日糧能量水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期的影響

盧勁曄+劉靜+盧煒+等

摘要：選取18只青年波雜山羊隨機(jī)分成高能量組與低能量組，在細(xì)胞和分子水平闡述瘤胃上皮增殖及其機(jī)理。結(jié)果顯示：高能量日糧提高山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表達(dá)，加速細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快瘤胃乳頭生長，揭示了高能量日糧促進(jìn)瘤胃乳頭生長的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。

關(guān)鍵詞：高能量日糧；山羊；瘤胃上皮；細(xì)胞周期；Cyclin D1

中圖分類號： S827.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0145-04

收稿日期：2013-09-18

資助項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30771568）；國家“973”計(jì)劃（編號：2011CB100801）

作者簡介：盧勁曄（1983—），男，江蘇揚(yáng)州人，博士，講師，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)生理研究。Tel：（0523）86853000；E-mail：leopardleo@163.com。

通信作者：沈贊明，從事動(dòng)物營養(yǎng)生理研究。E-mail：zmshen@njau.edu.cn。瘤胃是反芻動(dòng)物消化代謝、營養(yǎng)吸收最重要的場所之一，瘤胃上皮吸收動(dòng)物消化產(chǎn)生的能量、營養(yǎng)物質(zhì)，瘤胃上皮的生長發(fā)育情況直接影響反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能。提高動(dòng)物日糧能量水平可以促進(jìn)山羊瘤胃上皮生長及山羊個(gè)體生長[1]。哺乳動(dòng)物體細(xì)胞數(shù)量增多是通過加快細(xì)胞的有絲分裂來完成的，細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)有序過程稱為細(xì)胞周期。細(xì)胞周期運(yùn)行主要受細(xì)胞周期蛋白（cyclin）及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平直接影響細(xì)胞有絲分裂的速率[2]。本研究探討高能量日糧對山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期以及CDK的影響，旨在為提高山羊生產(chǎn)性能提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

選用18只青年波雜山羊（波爾山羊×淮南羊雜交山羊，平均日齡為90 d）作為試驗(yàn)對象。試驗(yàn)開始前，對山羊進(jìn)行驅(qū)蟲，山羊自由飲水，采食花生稈，逐漸添加精料至400 g/d，適應(yīng)期30 d。試驗(yàn)正式開始后，根據(jù)體重相近原則，將山羊隨機(jī)分為高能量組（ME：1.00 MJ/（kg0.75·d），約為維持水平的2.0倍）及低能量組（ME：0.60 MJ/（kg0.75·d），約為維持水平的1.2倍），高能量組及低能量組各9只山羊。所有山羊均單圈飼養(yǎng)，自由飲水，采食花生稈，日糧營養(yǎng)組成見表1。高能量組山羊每天08：00、11：00、14：00、17：00分別飼喂1次100 g精料（精料組成見表1），持續(xù)飼喂42 d，第43天屠宰取樣。

1.2主要試劑

碘化丙啶（Sigma公司），RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、dNTP（Promega公司），RevertAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA

山羊日糧的組成成分

日糧干物質(zhì)

（%）干基營養(yǎng)成分含量（%）粗蛋白質(zhì)粗脂肪粗纖維粗灰分干物質(zhì)代謝能

（MJ/kg）飼料87.7523.804.157.608.8110.85花生稈89.818.152.2531.467.136.96注：精料由玉米、豆粕、棉籽、麩皮、魚粉、磷酸鈣、微量元素、維生素組成。

聚合酶試劑盒（Fermentas公司），引物設(shè)計(jì)與合成（Invitrogen公司），iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司），蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Pierce公司），PVDF膜（Millipore公司），兔抗Cyclin D1多克隆抗體、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Bioworld公司），鼠抗CDK4單克隆抗體（Abcam公司）。

1.3流式細(xì)胞術(shù)測定山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期

1.3.1瘤胃上皮細(xì)胞的分離與固定取約300 mg組織塊，用D-Hanks溶液（pH值為7.4，4倍雙抗，37 ℃水浴預(yù)溫）漂洗2～3次后，加0.25%胰酶15 mL，37 ℃水浴，30 min后棄去消化液，取出瘤胃上皮組織，重復(fù)3次上述步驟。在處理后的上皮組織中加D-Hanks溶液（pH值為7.4）清洗2次，繼續(xù)加入胰酶15 mL消化10 min，1 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞。用PBS緩沖液（pH值為7.4）洗滌細(xì)胞沉淀2次，2 mL預(yù)冷75%乙醇重懸細(xì)胞，混勻后4 ℃保存待測。

1.3.2碘化丙啶（PI）染色與流式細(xì)胞儀檢測將用75%乙醇固定的細(xì)胞用PBS緩沖液（pH值為7.4）洗滌2次以除去乙醇，再用50 μL PBS緩沖液（pH值為7.4）重懸，加入 500 μL PI染液，振蕩混勻，室溫避光染色15 min，用流式細(xì)胞儀檢測，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，用CellQuest軟件測定細(xì)胞大小及細(xì)胞DNA含量等數(shù)據(jù)。

1.4RT-PCR法檢測山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期蛋白、蛋白激酶mRNA

1.4.1樣品總RNA提取取約100 mg瘤胃上皮組織，用手持電動(dòng)勻漿機(jī)徹底勻漿后采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取瘤胃上皮總RNA。用微量核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度及純度，所有樣品RNA的D260 nm/D280 nm比值均為1.8～2.0。用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的質(zhì)量，樣品條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，且28 S與18 S條帶灰度之比約等于2.0，表明RNA無降解、質(zhì)量可靠。調(diào)整RNA濃度為 1 μg/μL，-80 ℃保存。

1.4.2反轉(zhuǎn)錄（RT）用隨機(jī)引物同時(shí)對所有樣品的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到各樣品的cDNA。反應(yīng)總體積為25 μL，包括2 μg RNA、0.8 mmol/L dNTP、10 μmol/L隨機(jī)引物、5 U RNA酶抑制劑、100 U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。先加RNA模板、dNTP、隨機(jī)引物，70 ℃變性5 min，使引物及模板配對。變性后立即置于冰上冷卻，再加入RNA酶抑制劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，37 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃滅活5 min，將RT產(chǎn)物置于 -20 ℃ 冰箱中保存。

1.4.3PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上牛的基因引物序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物（表2）。表2PCR擴(kuò)增引物參數(shù)

基因引物序列來源大小

（bp）退火溫度

（℃）18S rRNA正向：5′-CGGACATCTAAGGGCATCA-3′；反向：5′-AAGACGGACCAGAGCGAAA-3′DQ222453.153858Cyclin D1正向：5′-CCTGCCGTCCATGCGGAA-3′；反向：5′-GAACTTCACATCTGTGGCAC-3′NM_001046273.143060Cyclin A正向：5′-ACAGTATGAGGGCTATCC-3′；反向：5′-TGTGGTGCTCTGAGGTAG-3′NM_001075123.158658CDK2正向：5′-GCTTTCTGCCACTCTCAT-3′；反向：5′-GCTCCGTCCATCTTCATC-3′NM_001014934.143858CDK4正向：5′-CGTTGGCTGTATCTTTGC-3′；反向：5′-GATTCGCTTGTGTGGGTT-3′NM_001037594.125658CDK6正向：5′-GCAGTATGAGTGCGTGG-3′；反向：5′-TTATGGTTTCAGTGGGC-3′XM_58915133552

1.4.4PCR擴(kuò)增將所有待測RT產(chǎn)物的等比例混合樣對反應(yīng)條件及循環(huán)圈數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體積為25 μL，包括2 μL上、下游引物（其中18S rRNA引物為0.12 μmol/L，其他目的基因引物為0.6 μmol/L），2 μL RT產(chǎn)物，0.1 μL（1 U）Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer（含100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl、1.0% Triton X-100），0.8 μL 0.32 mmol/L dNTP，1.8 μL MgCl2。PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52～60 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸40 s，重復(fù)32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。同時(shí)用ddH2O、RNA樣品分別取代RT產(chǎn)物作為對照，以檢驗(yàn)是否有外源性、基因組DNA污染。

1.4.5電泳及結(jié)果分析PCR反應(yīng)結(jié)束后，取18 μL PCR產(chǎn)物與2 μL 10 ×上樣Buffer混勻后上樣于2%瓊脂糖凝膠中（含0.1 μg/mL溴化乙錠）。在1×TAE電泳緩沖液中100 V電壓下電泳30 min，采用Marker DL2000同時(shí)電泳作為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，采用Kodak 1D圖像分析系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。

1.5Real-time Q-PCR法檢測山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4 mRNA表達(dá)

以18S rRNA為內(nèi)標(biāo)基因，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time Q-PCR）進(jìn)行相對定量。根據(jù)GenBank上的牛的基因引物序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。Cyclin D1基因編號為EU525165.1，正向：5′-TTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向：5′-CCACCACCCTGTTACTGTT-3′。CDK4基因編號為NM_001127269.1，正向：5′-TGAGCATCCCAGTGTTGT-3′，反向：5′-CCTTGTCCAGATACTTCCT-3′。18S rRNA基因編號為DQ222453，正向：5′-GAAACGGCTACCACATCC-3′，反向：5′-ACCAGACTTGCCCTCC-3′。反應(yīng)體積20 μL，包括 2 μL RT產(chǎn)物，2 μL上、下游引物，1× iQ SYBR Green supermix。用所有待測RT產(chǎn)物的混合樣（每份待測樣品等體積混合）對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。通過熔點(diǎn)曲線判斷是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體出現(xiàn)，單一產(chǎn)物的熔點(diǎn)曲線只有1個(gè)單一峰，沒有雜峰，也不出現(xiàn)主峰的異常增寬。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。ΔΔCt計(jì)算公式如下。

1.6Western Blot檢測山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4含量

1.6.1樣品蛋白的提取參照試劑盒說明書提取瘤胃上皮組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.6.2變性電泳取50 μg蛋白樣品與6×SDS上樣緩沖液按5 ∶1（體積比）混合均勻，100 ℃煮沸5 min，自然冷卻后加樣，5%濃縮膠、10%分離膠分別在80、100 V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)前沿移動(dòng)至凝膠底部。

1.6.3轉(zhuǎn)印電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為電流1 mA/cm2，反應(yīng)時(shí)間為40 min。

1.6.4封閉、抗體孵育轉(zhuǎn)印完畢后，取出PVDF膜，置于含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。封閉完成后用TBST清洗PVDF膜上多余的奶粉，一抗（Cyclin D1和CDK4 1 ∶1 000 TBST稀釋，GAPDH 1 ∶5 000 TBST稀釋）中4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌后，繼續(xù)在二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG，1 ∶6 000 TBST稀釋）中室溫孵育1 h。

1.6.5發(fā)光、照相TBST充分洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液，暗室曝光、顯影、定影，在膠片上獲得相應(yīng)的蛋白條帶。

1.7數(shù)據(jù)處理

用Kodak 1D凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行光密度測定，以目的條帶與GAPDH條帶的光密度比值代表目的條帶表達(dá)的相對水平。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1日糧能量水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期的影響HL組山羊瘤胃上皮細(xì)胞S期、G2/M期細(xì)胞百分率均顯著高于LL組，G0/G1期細(xì)胞百分率顯著低于LL組。由此可知，高能量日糧能加速山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

日糧能量水平對山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期的影響

組別細(xì)胞百分率（%）G0/G1期S期G2/M期低能量組（LL）89.19±1.319.09±1.441.72±0.39高能量組（HL）81.16±1.24*14.96±1.33*3.87±0.65*注：“*”表示與LL組相比差異顯著，各期細(xì)胞百分率測定以檢測10 000個(gè)細(xì)胞為基準(zhǔn)。

2.2細(xì)胞周期蛋白和蛋白激酶基因在山羊瘤胃上皮的表達(dá)

Cyclin D1、Cyclin A、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA 在山羊瘤胃上皮均有表達(dá)。

2.3日糧能量水平對山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

HL組山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平顯著高于LL組。由圖3可知，Western Blot法檢測出 Cyclin D1蛋白在山羊瘤胃上皮均有表達(dá)。HL組山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著高于LL組。由此可知，高能量日糧能促進(jìn)山羊瘤胃上皮G1期細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1蛋白表達(dá)。

2.4日糧能量水平對山羊瘤胃上皮CDK4 mRNA、蛋白表達(dá)的影響

CDK4 mRNA表達(dá)水平在HL組與LL組之間差異不顯著。由圖5可知，Western Blot法檢測出CDK4蛋白在山羊瘤胃上皮表達(dá)。HL組山羊瘤胃上皮CDK4蛋白表達(dá)水平顯著高于LL組。由此可知，高能量日糧通過促進(jìn)山羊瘤胃上皮Cyclin D1-CDK4復(fù)合物形成，推動(dòng)G1期細(xì)胞進(jìn)入S期。

3結(jié)論與討論

高能量飼料能促進(jìn)青年奶牛瘤胃乳頭生長[3-4]。Stobo等研究表明，與粗料相比，高能量精料能促進(jìn)犢牛體重增加，提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度，刺激瘤胃上皮乳頭增大[5]。研究表明，高能量日糧能促進(jìn)多種反芻動(dòng)物，包括山羊、綿羊、牛的瘤胃上皮乳頭生長[6-9]。測定動(dòng)物機(jī)體及其器官生長最經(jīng)典的表觀指標(biāo)是質(zhì)量。器官質(zhì)量的改變可通過細(xì)胞數(shù)量性增生或細(xì)胞肥大完成。細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)有序過程稱為細(xì)胞周期。完成1次細(xì)胞周期后，1個(gè)母細(xì)胞分裂為2個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期由G1期（生長期，DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有絲分裂期）多個(gè)環(huán)節(jié)組成。本研究發(fā)現(xiàn)，高能量日糧山羊瘤胃上皮細(xì)胞G1期細(xì)胞百分率降低，S期、G2/M期細(xì)胞百分率升高，說明高能量日糧能加速山羊瘤胃上皮細(xì)胞G1期進(jìn)程，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期、G2/M期，從而加速細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期進(jìn)程受到細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）復(fù)合物的調(diào)節(jié)。每種Cyclin與相應(yīng)CDK裝配形成具有全酶活性Cyclin-CDK復(fù)合物，通過底物磷酸化作用確保細(xì)胞周期各個(gè)階段順利運(yùn)行。Cyclin D-CDK4/6復(fù)合物、Cyclin E-CDK2復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程[10]。Cyclin A-CDK2復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期進(jìn)程，之后由Cyclin B-CDK1（cdc2）復(fù)合物推動(dòng)G2期、M期運(yùn)行。本研究表明，Cyclin D1、CDK4 的mRNA及蛋白在山羊瘤胃上皮中均有表達(dá)，高能量日糧條件下山羊瘤胃上皮細(xì)胞細(xì)胞周期G1期進(jìn)程加快與G1期細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1及CDK4表達(dá)升高有關(guān)。Cyclin D1從G1早期開始合成，持續(xù)合成并累積至G1中期，與CDK4、CDK6形成Cyclin D1-CDK4/6復(fù)合物。G0期、G1早期的Rb蛋白處于低磷酸化水平，Cyclin D1-CDK4復(fù)合物磷酸化Rb蛋白的S795位點(diǎn)，釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子[11]。G1晚期在Cyclin E-CDK2參與下，Rb蛋白多個(gè)位點(diǎn)（S780、S795、S807、S811）高度磷酸化，釋放全部E2F轉(zhuǎn)錄因子[12-13]，活化的E2F啟動(dòng)下游細(xì)胞周期的進(jìn)程關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄[14]，從而使細(xì)胞周期從G1期順利進(jìn)入S期。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中G1期細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E的合成受到多種外界因素的調(diào)節(jié)，日糧能量水平是其中最重要的因素之一。提高日糧能量水平能促進(jìn)小鼠體重增加、提高復(fù)層上皮細(xì)胞及肝臟上皮細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)[15]。Kobayashi等給大鼠飼喂不同能量水平日糧，高能量組大鼠前列腺上皮Cyclin D1表達(dá)較低能量組顯著升高、細(xì)胞增殖加快[16]。限制大鼠的日糧能量攝入后，大鼠乳腺上皮細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)水平下降，其下降幅度與日糧能量降低幅度呈正相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，早期肝臟上皮細(xì)胞的異常增生、癌變與攝入大量高能量食物有關(guān)，飼喂高能量日糧能提高大鼠肝臟上皮細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快[18]。研究表明，Cyclin D1、Cyclin E表達(dá)升高均能導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期進(jìn)程加快。Resnitzky運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使大鼠成纖維細(xì)胞Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1、Cyclin E蛋白過表達(dá)的未同步化的體外培養(yǎng)大鼠成纖維細(xì)胞G1期進(jìn)程均較對照組顯著加快，Cyclin B1過表達(dá)則對細(xì)胞周期進(jìn)程無影響，表現(xiàn)為Cyclin D1組、Cyclin E組較對照組G1期細(xì)胞百分率降低，S期、G2/M期細(xì)胞百分率升高；Cyclin B1組與對照組G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分率均無顯著差異[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1異位過表達(dá)的大鼠肝臟上皮細(xì)胞較正常表達(dá)組G1期時(shí)間縮短，細(xì)胞體積變小[20-21]。研究人員體外用鋅處理停滯在G1期的人乳腺上皮細(xì)胞，提高Cyclin D1蛋白表達(dá)，15 h后33%～38%的細(xì)胞進(jìn)入S期，相反，當(dāng)Cyclin D1蛋白表達(dá)水平下降時(shí)，Cyclin D1-CDK4復(fù)合物活化水平降低，細(xì)胞周期停滯在G1期。據(jù)報(bào)道，體外添加SJSZ糖蛋白能抑制肝臟上皮細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)，同時(shí)提高細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI）p53、p21、p27蛋白表達(dá)，抑制Cyclin D1-CDK4活化，進(jìn)而使其細(xì)胞周期停滯在G1期[22]。高能量日糧對大鼠細(xì)胞周期的影響也主要作用在G1期[23]。細(xì)胞周期G1期的調(diào)節(jié)由Cyclin D1-CDK4復(fù)合物與Cyclin E-CDK2復(fù)合物共同完成，但是Cyclin D1-CDK4復(fù)合物合成要先于Cyclin E-CDK2復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin E的表達(dá)依賴于Cyclin D1-CDK4復(fù)合物的活化，并且Cyclin D1表達(dá)促進(jìn)Cyclin E的合成。

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