角喙栓蚤蠅減數(shù)分裂行為觀察

李翠軍+馮典興+劉廣純

摘要：以精巢和卵巢組織為材料，采用空氣干燥制片法，吉姆薩和硝酸銀分別染色，對角喙栓蚤蠅（Dohrniphora cornuta）減數(shù)分裂染色體形態(tài)行為進行研究。結(jié)果表明：角喙栓蚤蠅染色體的二倍體數(shù)目為2n=8，最小的一對染色體著色較深，推測為性染色體，性染色體不存在異型現(xiàn)象。粗線期同源染色體完成配對纏繞在一起，2條性染色體提前完成解螺旋；雙線期分開的同源染色體呈現(xiàn)許多交叉，這些交叉聯(lián)結(jié)是粗線期非姐妹染色體間發(fā)生交換的結(jié)果；后期性染色體呈短棒狀先抵達兩側(cè)，證實其為端著絲粒染色體，較常染色體移動速度快。該種減數(shù)分裂過程中未發(fā)現(xiàn)B染色體存在。

關(guān)鍵詞：角喙栓蚤蠅；精巢；卵巢；減數(shù)分裂；硝酸銀；吉姆薩；染色體

中圖分類號： Q952.6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0125-04

收稿日期：2014-02-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31071965，81102296）。

作者簡介：李翠軍（1986—），女，遼寧朝陽人，碩士，從事細胞遺傳學研究。E-mail：licuijun816@163.com。

通信作者：劉廣純，教授，從事蚤蠅學研究。E-mail：liugc01@163.com。蚤蠅是雙翅目中較大科之一，是農(nóng)、林、醫(yī)等領(lǐng)域主要害蟲，有些類群在生物防治和法醫(yī)鑒定領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[1]。對蚤蠅染色體結(jié)構(gòu)數(shù)量變異、分裂行為和特殊染色體進行研究，揭示其種類演替、進化和種內(nèi)進化的客觀規(guī)律，可為分類系統(tǒng)建立、近緣種區(qū)分乃至種下分類問題提供新的方法和技術(shù)。目前，已知核型的蚤蠅共6種，分別為蛆癥異蚤蠅（Megaselia scalaris）[2-4]、東亞異蚤蠅（Megaselia spiracularis）[5]、廣東柵蚤蠅（Diplonevra peregrina）[6]、Pseudacteon curvatus、Pseudacteon nocens和Pseudacteon tricuspis[7]。其中，廣東柵蚤蠅二倍體染色體數(shù)目2n=8，性染色體雌雄異型，另外5種蚤蠅的二倍體染色體數(shù)目均為2n=6，不存在明顯的性染色體異型現(xiàn)象。同型染色體種類的性別可能由雄性因子M決定[8-9]，或由環(huán)境刺激決定[10]。本試驗以角喙栓蚤蠅（Dohrniphora cornuta）為試材，對其染色體減數(shù)分裂各時期行為特征進行研究，旨在為蚤蠅科系統(tǒng)進化、遺傳防治和分子遺傳學奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

角喙栓蚤蠅由沈陽大學城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點實驗室飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1染色體標本制作參照馮典興等的空氣干燥法[2]。在Ringers液中解剖出蛹期的性腺，移至固定液（甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1）中固定15～20 min，然后置于滴有少許60%冰醋酸的載玻片上解離10 min左右，用解剖針將材料充分攪碎，滴1滴固定液將細胞打散，放于50 ℃的電熱板上使液體迅速蒸干，染色體充分展開固定在玻片上。

1.2.2染色體標本染色將上述處理的玻片標本用 1/10吉姆薩染液（pH值6.8）扣染至少30 min，用蒸餾水沖凈玻片表面的染液，置于室溫下無塵處自然干燥。

1.2.3染色體快速銀染參照Howell等的方法[11]。在 60 ℃ 水浴鍋中避光染色，玻片標本細胞面向上放于有濕濾紙的容器中。在玻片標本有細胞的位置，按2 ∶1的比例滴加50%硝酸銀和明膠顯影液，避光染色5 min左右（玻片呈金黃色為止）。取出立即用溫蒸餾水漂洗染液，小心不要劃掉玻片上的染色體，置于室溫下無塵處自然晾干。

1.2.4染色體的觀察拍照將干燥好的染色體玻片在 Olympus 相差光學顯微鏡下觀察分析，選取分散良好的分裂相拍照。

2結(jié)果與分析

精巢形成初期在解剖鏡下顯示為透明的圓點狀，此時制片得到的結(jié)果中混雜的有絲分裂相較多。當精巢發(fā)育呈橢球形時，有絲分裂相較少，甚至全是精子。因此，選擇精巢從小圓點發(fā)育到近橢球形的時期（23 ℃環(huán)境下7～8 d），可以較容易得到減數(shù)分裂各個時期。同樣情況下雌蛹卵巢制片也可以得到較多的分裂相，但減數(shù)第二次分裂過程較難觀察到，得到的分裂相中大部分為減數(shù)第一次分裂，還有部分有絲分裂相。

銀染技術(shù)可以使核仁形成區(qū)（NORs）呈特異性著色，還可以用于著絲粒、中心粒、減數(shù)分裂聯(lián)會復合體、性泡和染色體軸的研究。本試驗中4對染色體全部著色但沒有明顯的分帶現(xiàn)象，與基本的吉姆薩染色結(jié)果相似，遂選精巢染色體減數(shù)分裂硝酸銀染色和卵巢染色體減數(shù)分裂吉姆薩染色統(tǒng)一描述。

細線期：一團染色體細線散于核仁附近（圖1-a、圖2-a），每根細絲是由復制后的2條姐妹色單體組成。細線期完成后各同源染色體聯(lián)會。

偶線期：染色體線狀縮短變粗（圖1-b、圖2-b）。核仁沒有明顯的形態(tài)變化，同源染色體聯(lián)會，聯(lián)會復合體開始形成，每條線狀染色體實際上包含了4條染色體單體，又稱四合體或四聯(lián)體。此時仍不能分清性染色體和染色體的條數(shù)。

粗線期：同源染色體已經(jīng)完全配對，常染色體的同源染色體互相緊靠纏繞在一起，呈現(xiàn)3個中間有拐點的長棒狀染色體對和2個短棒狀性染色體。染色體著絲粒位置較集中，染色體臂自著絲粒處向外擺出，2條性染色體獨立存在于著絲粒附近（圖1-c、圖2-c，箭頭所示）。

雙線期：二價體中同源染色體分開，8條染色體中3對常染色體的同源染色體著絲粒處依然緊靠，染色體臂呈現(xiàn)許多交叉（圖1-d、圖2-d，箭頭所示）。染色體交叉聯(lián)結(jié)在一起的現(xiàn)象，是粗線期非姐妹染色體間發(fā)生交換的結(jié)果。

終變期：染色體長度、粗細接近中期I染色體，交叉減少，可清晰看到3對常染色體和1對性染色體（圖1-e、圖2-e）。

中期Ⅰ：染色體聚縮程度最大，常染色體邊緣變光滑，此時依稀可見復制后的姐妹染色單體，16條姐妹染色單體兩兩緊靠在一起，呈現(xiàn)8條狀，染色體整齊排列（圖1-f、圖2-f），箭頭示深染的性染色體。染色體形態(tài)與有絲分裂中期相似。

后期Ⅰ：同源染色體分向兩側(cè)，姐妹染色體單體不再緊靠，常染色體自著絲粒起四臂分開，性染色體呈“八”字形，此時染色體條數(shù)最清晰（圖1-g、圖2-g），性染色體移動較快先抵達兩側(cè)。

末期Ⅰ：達到兩側(cè)的染色體聚集成堆（圖1-h、圖2-h）。仔細觀察，有的細胞狀結(jié)構(gòu)中能見到?jīng)]有解聚的染色體輪廓，推測為減Ⅱ間期。

前期Ⅱ：能看到與減Ⅰ粗線期分裂行為相近的染色體，但是此時沒有細胞核結(jié)構(gòu)，只見3條長線狀染色體和聚成一團的性染色體（圖1-i），線狀染色體由結(jié)合在一起的姐妹染色單體組成，性染色體聚在一起，不像減Ⅰ粗線期可分清染色體條數(shù)。

中期Ⅱ：染色體縮短壓縮到最大程度，4對姐妹染色單體排成一排（側(cè)面觀），主溢痕明顯斷裂突出著絲粒端（圖1-j，箭頭所示）。

后期Ⅱ：姐妹染色體漸漸分開，性染色體較常染色體移動得快，先達到兩側(cè)（如1-k、圖2-i）。

末期Ⅱ：末期持續(xù)時間較短，卵巢中未能觀察到，只見圓形深染的卵細胞。精巢染色體末期并行達到兩端，聚集成簇，輪廓漸近紡錘形（圖1-l），準備形成精細胞。

3討論

角喙栓蚤蠅染色體銀染后，4對染色體全部著色，但沒有明顯的分帶現(xiàn)象。可能的原因是染色體所處時期不利于染色或染色體活潑轉(zhuǎn)錄區(qū)域活性低；或是核仁形成區(qū)較小，難以辨別；再有就是標本制備時表面張力過大，致使銀染物質(zhì)消失。

減數(shù)第一次分裂中期與有絲分裂中期染色體形態(tài)沒有明顯差別，這與有絲分裂過程存在體細胞配對現(xiàn)象有關(guān)；但在減數(shù)第一次分裂后期染色體排列較緊密，同源染色體間緊密程度高于有絲分裂后期。

減數(shù)分裂一些重要過程主要發(fā)生在第一次分裂中，特別是前期Ⅰ。前期Ⅰ的5個時期持續(xù)時間不同，持續(xù)時間長的容易見到，持續(xù)時間短的就很難觀察到，而且各期持續(xù)時間的長短隨種類的不同而不一樣。這一現(xiàn)象在卡內(nèi)里虱蠅[12]、淡色庫蚊[13]和廣東柵蚤蠅[14]減數(shù)分裂中均有報道。角喙栓蚤蠅前期Ⅰ的偶線期、粗線期、雙線期較常見，細線期和終變期次之。減數(shù)第二次分裂過程持續(xù)時間短，很難觀察到，已有蚤蠅減數(shù)分裂研究中，僅蛆癥異蚤蠅減數(shù)第二次的后期有過報道。本試驗首次對蚤蠅減數(shù)第二次分裂過程進行了較完整觀察。

粗線期和后期是觀察染色體的最佳時期。在粗線期，可見3條細長的二價體和1對短小的染色體；減數(shù)第二次分裂后期，每側(cè)可見3條“V”形染色體和1條短棒狀染色體。從而證明角喙栓蚤蠅染色體數(shù)2n=8，由3對中著絲粒染色體和1對端著絲粒染色體組成。對角喙栓蚤蠅染色體進行硝酸銀染色顯示，最短的1對染色體著色較深、致密，并且這對染色體分裂行為有別于其他染色體，在粗線期，這對染色體較其他染色體提前分開；在后期Ⅱ，也較其他染色體移動得快，推測其為性染色體。本試驗未能觀察到雌雄個體性染色體間差別，2條性染色體間差別需通過RAPD、熒光原位雜交等技術(shù)近一步研究。在核型已知的蚤蠅中，除了廣東柵蚤蠅性染色體異型外，其他蚤蠅性染色體均不易區(qū)分，可能這種性染色體同型現(xiàn)象在蚤蠅科中較普遍。

Wolf等相繼報道M. scalaris和M. spiracularis中除3對染色體之外，還存在類著絲粒元件，即B染色體[5，16-18]，形態(tài)類似于著絲粒，不具染色體臂。B染色體的數(shù)目在不同物種

間和同一個體不同細胞間以及減數(shù)分裂和有絲分裂的各個時期都有所不同，導致它們行為的復雜性。在有絲分裂和減數(shù)分裂期間，大多數(shù)B染色體是穩(wěn)定的，并且高度異染色質(zhì)化，通常不與任何A染色體配對，在細胞中隨機分布，數(shù)目變化較大。在減數(shù)分裂時B染色體不分離，具有一定的積累和消減機制。通過對角喙栓蚤蠅減數(shù)分裂觀察，在4對染色體無論聯(lián)會還是染色體分離都正常未受干擾，未發(fā)現(xiàn)B染色體存在。

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