拮抗放線菌06—6的篩選鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

郝永麗+宗兆鋒+高博+胡海波+曲寶茹

摘要：從采集的土樣中分離出拮抗放線菌，并篩選出對4種靶標菌均具有明顯拮抗效果的菌株06-6，對該菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化及生理生化鑒定，從而確定該菌株的最佳發(fā)酵技術參數(shù)，通過鑒定初步將其歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。

關鍵詞：拮抗放線菌；篩選；鑒定；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號： Q939.92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0107-03

收稿日期：2013-09-25

基金項目：教育部創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（編號：200558）；國家高等學校學科創(chuàng)新引智計劃（編號：B07049）。

作者簡介：郝永麗（1981—），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士，助理研究員，從事園藝植物病蟲害防治研究。E-mail：yonglihao1981@163.com。拮抗菌作為一種具有豐富資源的微生物類群，其產(chǎn)生的抗生素及其他次生代謝物質(zhì)在農(nóng)作物病蟲害生物防治方面具有重要作用，是具有使用價值和經(jīng)濟價值的一類微生物，在植物病蟲害生物防治中應用前景廣[1-4]。利用拮抗放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)進行真菌病害防治，具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)、無毒害等優(yōu)點。本研究旨在從采集的土樣中分離篩選殺菌力強、抗菌譜廣的拮抗放線菌；并對其發(fā)酵條件和分類進行研究，為優(yōu)勢拮抗放線菌在生物防治中的應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣來源試驗用土壤標本分別采集于陜西商洛、周至、乾縣、戶縣及山東諸城。

1.1.2供試病原菌供試靶標菌由西北農(nóng)林科技大學微生物實驗室提供，包括番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）和粉紅聚端孢（Trichothecium roseum）。

1.2篩選方法

1.2.1菌株的分離與純化采集的土壤過篩，研磨后稱取 0.1 g 樣品，制備成不同濃度的稀釋液[5]。用移液器吸取特定稀釋濃度的液體20 μL，滴在高氏培養(yǎng)基表面，涂勻。將皿倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，幾天后從皿內(nèi)分離出單菌落，用顯微鏡檢純化，保存于G氏斜面中。

1.2.2拮抗放線菌的篩選用打孔器將培養(yǎng)好的放線菌菌苔打成直徑5 mm的菌餅置于PDA平板中間，3 d后將同樣大小的4種供試病原真菌菌餅對峙接于兩側(cè)，21 ℃下培養(yǎng)，觀察并測量抑菌圈的大小。將初篩得到的菌株于SNB培養(yǎng)液中振動培養(yǎng)，發(fā)酵液離心后取上清液，采用微孔擴散法測定發(fā)酵液及發(fā)酵濾液的抑菌活性，供試靶標菌為西瓜枯萎菌。

1.3拮抗菌的形態(tài)和生理生化鑒定

將待鑒定的菌株作插片培養(yǎng)，觀察記載其生長情況、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲的顏色、形態(tài)及是否產(chǎn)生可溶性色素[6]。菌株生理生化鑒定參照文獻[7]，包括淀粉水解、H2S產(chǎn)生、黑色素產(chǎn)生、碳源利用、纖維素水解、牛奶凝固和液化等[8]。

1.4拮抗菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1培養(yǎng)基的篩選將菌株06-6分別接種于13種液體發(fā)酵培養(yǎng)基（具體成分見表1）中，28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6 d，將發(fā)酵液離心，取其上清液備用。選擇西瓜枯萎菌為靶標菌，在準備好的PDA平板上均勻涂好靶標菌。將3張9 mm2大小的濾紙片均勻鋪于PDA平板上，每張小紙片滴入10 μL的發(fā)酵上清液。3 d后測量數(shù)據(jù)，用抑菌圈直徑表示不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的菌株06-6對病原菌拮抗作用的強弱。1.4.2最適裝液量pH值自然，分別在250 mL三角瓶中加入DBY液體培養(yǎng)基25、50、75、100、125、150 mL。滅菌后接種菌株06-6，置搖床發(fā)酵培養(yǎng)6 d后，將各發(fā)酵上清液分別加入到準備好的PDA平板中央[9]。5 d后測量抑菌作用。

1.4.3最佳發(fā)酵時間pH值自然，250 mL三角瓶中接種 06-6 菌懸液，置搖床培養(yǎng)，分別于4、5、6、7、8、9 d時測量抑菌作用，確定最宜發(fā)酵時間。

1.4.4發(fā)酵初始pH值利用選擇好的瓶裝量和培養(yǎng)時間，將初始pH值分別調(diào)至6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。測量抑菌作用。

2結果與分析

2.1拮抗菌株的分離和篩選

利用稀釋分離法，從采集的土樣中分離放線菌。結果表明，在分離出的放線菌中對4種病原真菌有很強抑制作用的菌株有4株，其中菌株06-6無論在皿內(nèi)拮抗試驗還是在發(fā)酵液抑菌作用測定方面都表現(xiàn)出極強的抑菌效果。

2.2拮抗菌06-6的形態(tài)和生理生化特征

2.2.1形態(tài)特征菌株06-6在高氏一號培養(yǎng)基中，氣生菌絲直，呈灰色；基內(nèi)菌絲培養(yǎng)初期為白色，到孢子成熟以后轉(zhuǎn)

表2菌株06-6的代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用

處理抑菌圈直徑（cm）灰葡萄孢西瓜枯萎菌粉紅聚端孢蘋果炭疽菌菌餅29.510.0 29.5 27.0 發(fā)酵液22.3 21.7 24.5 19.8

為橙黃色；孢子橢圓形，表面光滑，串生；孢子絲不結球。

2.2.2菌株06-6的生理生化特性菌株06-6可使牛奶鈍化，明膠不液化，淀粉水解；纖維素中能生長，但是不利用；不產(chǎn)生硫化氫。該菌可利用蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、肌糖、山梨糖、半乳糖、阿拉伯糖；不能利用木糖。

2.3拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1不同培養(yǎng)基對菌株抑菌活性的影響從圖1可以看出，菌株06-6在DBY、SNB、aSNB培養(yǎng)基中的發(fā)酵液抑菌率較高，其中對西瓜枯萎菌抑制效果最好是在DBY中培養(yǎng)的菌株發(fā)酵液，抑菌圈直徑達 23 mm。確定DBY為最佳培養(yǎng)基，配方為葡萄糖4.0 g、大豆粉0.5 g、酵母粉0.5 g、硫酸銨 0.5 g、NaCl 0.1 g、K2HPO4 0005 g。

2.3.2幾個發(fā)酵參數(shù)對發(fā)酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養(yǎng)基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發(fā)酵參數(shù)，即發(fā)酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養(yǎng)時間 6 d、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內(nèi)拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優(yōu)秀菌株06-6。皿內(nèi)檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內(nèi)對多數(shù)菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發(fā)酵參數(shù)研究

放線菌的發(fā)酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養(yǎng)基成分影響外，還受培養(yǎng)時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產(chǎn)菌種的最佳發(fā)酵技術參數(shù)，設計合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳發(fā)酵條件下，為其進行發(fā)酵罐培養(yǎng)和生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2.3菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據(jù)的結合，而不再是單純地形態(tài)分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統(tǒng)的經(jīng)典分類、數(shù)值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

參考文獻：

[1]徐劍宏，王建偉，胡曉丹，等. 小麥赤霉病菌拮抗菌AF0907的分離鑒定及其拮抗特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2013，29（3）：517-522.

[2]劉永鋒，陸凡，陳志誼，等. 拮抗細菌T429和T392的生物活性及其對水稻白葉枯病的防治效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（4）：733-737.

[3]周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1986.

[4]郭風柳，張海穎，李勇，等. 馬鈴薯瘡痂病拮抗菌株B1的鑒定及防效測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（5）：90-93.

[5]安德榮，慕小倩，劉翠娟，等. 土壤拮抗放線菌的分離和篩選[J]. 微生物學雜志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 農(nóng)用抗生素和抗生菌的篩選[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，1975：11-12.

[8]徐長倫，董平，吾提庫爾·馬合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素產(chǎn)生菌的鑒定[J]. 微生物學通報，1994，21（6）：350-352.

[9]莊敬華，高增貴，劉限，等. 不同發(fā)酵條件對木霉產(chǎn)孢類型的影響[J]. 中國生物防治，2005（1）：37-40.

[10]劉翠娟，段琦梅，安德榮. 抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 微生物學雜志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2幾個發(fā)酵參數(shù)對發(fā)酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養(yǎng)基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發(fā)酵參數(shù)，即發(fā)酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養(yǎng)時間 6 d、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內(nèi)拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優(yōu)秀菌株06-6。皿內(nèi)檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內(nèi)對多數(shù)菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發(fā)酵參數(shù)研究

放線菌的發(fā)酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養(yǎng)基成分影響外，還受培養(yǎng)時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產(chǎn)菌種的最佳發(fā)酵技術參數(shù)，設計合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳發(fā)酵條件下，為其進行發(fā)酵罐培養(yǎng)和生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2.3菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據(jù)的結合，而不再是單純地形態(tài)分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統(tǒng)的經(jīng)典分類、數(shù)值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

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[2]劉永鋒，陸凡，陳志誼，等. 拮抗細菌T429和T392的生物活性及其對水稻白葉枯病的防治效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（4）：733-737.

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[5]安德榮，慕小倩，劉翠娟，等. 土壤拮抗放線菌的分離和篩選[J]. 微生物學雜志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 農(nóng)用抗生素和抗生菌的篩選[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，1975：11-12.

[8]徐長倫，董平，吾提庫爾·馬合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素產(chǎn)生菌的鑒定[J]. 微生物學通報，1994，21（6）：350-352.

[9]莊敬華，高增貴，劉限，等. 不同發(fā)酵條件對木霉產(chǎn)孢類型的影響[J]. 中國生物防治，2005（1）：37-40.

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[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.

2.3.2幾個發(fā)酵參數(shù)對發(fā)酵液抑菌作用的影響本試驗在

以DBY為基礎培養(yǎng)基條件下，確定了菌株06-6的最適宜發(fā)酵參數(shù)，即發(fā)酵初始pH值7.5、瓶裝量50 mL、培養(yǎng)時間 6 d、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min

3結論與討論

3.1拮抗菌株的分離篩選

圍繞如何改進和提高植物病害生物防治的效果，找出具有高效生防作用的拮抗菌株，本試驗從采集的土樣中，通過皿內(nèi)拮抗試驗篩選出4株代表菌株，進一步篩選后得到優(yōu)秀菌株06-6。皿內(nèi)檢測作為篩選有效生防菌的重要指標，具有簡便快捷的特點，可以在短時間內(nèi)對多數(shù)菌株進行篩選。試驗所采用的供試靶標菌有限，可能會漏選一些對供試靶標菌之外的其他菌株有拮抗作用的菌株。

3.2菌株06-6發(fā)酵參數(shù)研究

放線菌的發(fā)酵是一個復雜過程，受諸多條件的影響。除受培養(yǎng)基成分影響外，還受培養(yǎng)時間、初始pH值、溫度、通氣量等因素的影響[10]。因此，必須研究生產(chǎn)菌種的最佳發(fā)酵技術參數(shù)，設計合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳發(fā)酵條件下，為其進行發(fā)酵罐培養(yǎng)和生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2.3菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

本試驗通過對菌株06-6的形態(tài)觀察和生理生化鑒定，將菌株初步歸類為灰紅紫類群（Griseorubroviolaceus）。近年來，放線菌的分類一般是化學分類和分子分類等幾種分類依據(jù)的結合，而不再是單純地形態(tài)分類和化學分類。對新分離的菌株，單靠一種分類方法是不可靠的，需要傳統(tǒng)的經(jīng)典分類、數(shù)值分類、化學分類、分子分類等幾種信息的綜合[11]。因此，該菌株的分類還有待于用分子鑒定等其他方法進行驗證。

參考文獻：

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[2]劉永鋒，陸凡，陳志誼，等. 拮抗細菌T429和T392的生物活性及其對水稻白葉枯病的防治效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（4）：733-737.

[3]周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1986.

[4]郭風柳，張海穎，李勇，等. 馬鈴薯瘡痂病拮抗菌株B1的鑒定及防效測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（5）：90-93.

[5]安德榮，慕小倩，劉翠娟，等. 土壤拮抗放線菌的分離和篩選[J]. 微生物學雜志，2002，22（5）：1-3.

[6]尹莘耘. 農(nóng)用抗生素和抗生菌的篩選[J]. 抗生素，1983，8（1）：64-65.

[7]中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，1975：11-12.

[8]徐長倫，董平，吾提庫爾·馬合木提，等. 防治哈密瓜疫霉病抗生素產(chǎn)生菌的鑒定[J]. 微生物學通報，1994，21（6）：350-352.

[9]莊敬華，高增貴，劉限，等. 不同發(fā)酵條件對木霉產(chǎn)孢類型的影響[J]. 中國生物防治，2005（1）：37-40.

[10]劉翠娟，段琦梅，安德榮. 抗真菌拮抗放線菌的篩選及搖床發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 微生物學雜志，2004，24（4）：12-14.

[11]Mehling A，Wehmeier U F，Piepersberg W. Nucleotide sequences of streptomycete 16S ribosomal DNA：towards a specific identification system for streptomycetes using PCR[J]. Microbiology，1995，141：2139-2147.