醫(yī)用再生絲素蛋白膜的制備及性能研究

陳 燕， 楊皓明， 蔡玉榮

(浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，教育部先進(jìn)紡織材料與制備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018)

醫(yī)用再生絲素蛋白膜的制備及性能研究

陳 燕， 楊皓明， 蔡玉榮*

(浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，教育部先進(jìn)紡織材料與制備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018)

[目的]以再生絲素蛋白為原料，制備致密再生絲素蛋白膜，通過優(yōu)選改性方法使得該膜具備一定的力學(xué)性能和不溶性、合適的降解速度等，以滿足將來在子宮內(nèi)膜修復(fù)中的應(yīng)用要求。[方法]將蠶絲脫膠、溶解得到再生絲素溶液，采用流延法鋪膜，并用無水乙醇和濃度0.1%戊二醛進(jìn)行不溶化處理，用蛋白酶XIV進(jìn)行降解試驗(yàn)，利用萬能拉伸機(jī)、FESEM、FTIR和失重法等方法對絲素蛋白膜的微觀形貌、力學(xué)性能、蛋白構(gòu)象和降解性等進(jìn)行測試。[結(jié)果]由再生絲素溶液可制備光滑致密的絲素蛋白膜，經(jīng)乙醇和戊二醛處理后，絲素分子中β-折疊結(jié)構(gòu)增多，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)減少，其力學(xué)性能增強(qiáng)，降解速度減慢。蛋白酶XIV可加速其降解。[結(jié)論]再生絲素蛋白膜在作為物理屏障用于預(yù)防和減少術(shù)后組織黏連方面有著極大的可能性。

絲素蛋白膜；構(gòu)象；酶降解

隨著人類生活節(jié)奏的加快，由于各種因素所導(dǎo)致的婦產(chǎn)科疾病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并且各種婦科腫瘤發(fā)病年齡趨于年輕化。近年來，盆腹腔手術(shù)日益增多。但是，術(shù)后可能出現(xiàn)的組織黏連嚴(yán)重影響了手術(shù)效果和患者生活質(zhì)量，加重了患者的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。據(jù)報(bào)道，67%～93%盆腹腔手術(shù)[1]會(huì)導(dǎo)致組織黏連,局部的黏連會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥如腸梗阻、不孕癥和慢性盆腔疼痛等，常需再次乃至多次手術(shù)治療[2]。黏連的發(fā)生機(jī)理非常復(fù)雜，涉及多種生化、細(xì)胞因子和病理改變，但最終都可以歸結(jié)為纖維蛋白的沉積超過了纖維蛋白的溶解[3]?，F(xiàn)有的術(shù)后防黏連材料主要有聚乳酸防黏連凝膠、聚乳酸防黏連膜、透明質(zhì)酸鈉凝膠和醫(yī)用殼聚糖膜四大類[4]。但是，就目前來看，它們或多或少都有些弊端，例如聚乳酸材料的降解物易引起患者腹痛、發(fā)熱等，且其凝膠在體內(nèi)的存留時(shí)間較長，其膜的貼附性差，易滑離；透明質(zhì)酸鈉屬于液態(tài)易流動(dòng)物質(zhì)，受體位的影響，易流出體外；醫(yī)用殼聚糖同樣受體位的影響，且材料活性的保持時(shí)間較短，因此有必要研發(fā)新型防黏連材料。絲素蛋白作為天然高分子具有來源廣、無毒、無污染、無刺激、生物相容性好及可降解等優(yōu)點(diǎn)。若以此為基質(zhì)，制備再生絲素蛋白膜，一方面可以起物理阻隔作用，另一方面其自身的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)細(xì)胞的生長，促進(jìn)內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)[5]。為此，筆者研究了再生絲素蛋白膜的制備，重點(diǎn)討論了絲素膜的力學(xué)性能、蛋白構(gòu)象、降解性等特征，以期為再生絲素蛋白膜的實(shí)際投入應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試桑蠶繭由湖州澳特斯生物科技有限公司提供；溴化鋰(LiBr)、戊二醛(GA,50%水溶液)購于上海阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇(C2H5OH)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、透析袋(截流分子量8 000～14 000)、PEG(分子量20 000)由杭州匯普化工儀器有限公司提供；灰色鏈霉菌蛋白酶(protease XIV)由北京北實(shí)縱橫科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法 將經(jīng)過脫膠的絲素纖維溶解于9.3 mol/L的LiBr溶液中，絲素蛋白纖維與溶液的質(zhì)量體積比為1∶4(12.5 g纖維溶于50 ml溶液中)，放入65 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩1 h,同一溫度下靜置溶解0.5 h，透析3 d,每隔12 h更換一次去離子水，然后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將所得再生絲素溶液過濾，并用去離子水稀釋至濃度5%，在下列條件下處理得到3種再生絲素蛋白膜。①取4 ml濃度5%的絲素溶液，澆鑄在聚乙烯盤中，于60 ℃烘箱中烘3.5 h；②取部分上述所得膜，浸泡在無水乙醇中24 h，待乙醇揮發(fā)后干燥保存；③在絲素溶液中加入濃度0.1%戊二醛，低速攪拌5 min，再取4 ml該溶液澆鑄在聚乙烯盤中，于60 ℃烘箱中烘3.5 h。將所制得的絲素膜用鈷60-伽馬射線輻射滅菌后備用。

將一定量鏈霉菌蛋白酶溶解在適量的去離子水中，得到0.1 U/ml降解用蛋白酶溶液[6-7]。將5 mg再生絲素蛋白膜加入于1 ml中性蛋白酶溶液中浸泡，同時(shí)準(zhǔn)備再生絲素蛋白膜樣品，置于PBS緩沖溶液中作為空白對照組。每24 h更換新鮮的酶溶液以保持酶的高活力，空白對照組每隔3 d更換PBS溶液。每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)平行樣。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)(第1、4、7、10、13、16天)取出樣品，經(jīng)充分洗滌后，稱重，記錄降解以后的質(zhì)量。所有的絲素膜樣品的處理方法、編號(hào)見表1。

表1 樣品編號(hào)

1.3 材料性能表征 將滅菌后的再生絲素蛋白膜制成40 mm×10 mm試樣，用Instron 3367型萬能拉伸機(jī)對其進(jìn)行力學(xué)性能測試。其中，樣品厚度為40 μm，測試溫度為室溫，夾持長度為20 mm，走樣速度為6 mm/min，平行樣5個(gè)以上[6]。將降解前后的再生絲素蛋白膜固定于樣品臺(tái)，經(jīng)真空鍍金后，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面和斷面形貌。采用Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀，用全反射傅里葉紅外光譜分析(ATR)分析降解前后再生絲素蛋白膜的構(gòu)象變化，測定范圍為4 000～8 00 cm-1,分辨率為4 cm-1。

2 結(jié)果與分析

采用乙醇和戊二醛對絲素膜進(jìn)行不溶化處理，并且對其力學(xué)性能進(jìn)行了分析。由圖1可知，添加戊二醛制備的絲素膜與經(jīng)乙醇表面處理所得絲素膜的斷裂強(qiáng)度相對未經(jīng)處理的絲素膜有明顯的提高，且提高的程度相差不大。這是因?yàn)樘砑游於┖?，戊二醛?個(gè)醛基可以與絲素分子形成共價(jià)交聯(lián)，增強(qiáng)絲素分子間的相互作用力，從而使得絲素膜的拉伸強(qiáng)度提高[7]；乙醇表面處理則能使蛋白質(zhì)變性，使得絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[8]，因而斷裂強(qiáng)度得以增加。但是，這2種處理方法對絲素膜斷裂伸長提高的影響不大。

滅菌前后絲素蛋白膜的構(gòu)象變化如圖2所示。未經(jīng)處理的再生絲素蛋白膜A-1在1 645、1 530和1 236 cm-1附近有特征吸收峰，分別代表絲素蛋白的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ區(qū)，表明絲素分子的蛋白構(gòu)象以無規(guī)卷曲為主。絲素膜經(jīng)乙醇表面處理(B-1)后，酰胺Ⅱ的特征吸收峰偏移到1 520 cm-1處。這是silkⅡ結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，表明絲素分子的蛋白構(gòu)象由原先的無規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)化[9-10]。添加戊二醛的絲素膜C-1與未經(jīng)處理的絲素膜相比，在1 520 cm-1處有出現(xiàn)新峰的趨勢，表明絲素膜中的無定型結(jié)構(gòu)含量減少，silkⅡ結(jié)構(gòu)含量增加。從圖2還可以看出，3種絲素膜在未滅菌前，1 625 cm-1均有特征吸收峰，經(jīng)滅菌處理后該處的特征吸收峰都消失了，而此處吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)的β-折疊構(gòu)象。這說明γ射線輻照減少了絲素中的silkⅡ結(jié)構(gòu)，使得絲素的無規(guī)結(jié)構(gòu)增多，對絲素分子的蛋白結(jié)構(gòu)有一定的影響。

圖1 不同方法處理的絲素膜的力學(xué)性能

圖2 滅菌前后絲素膜的FTIR圖譜

3種方法所制得的絲素蛋白膜的表面均為致密結(jié)構(gòu)(圖3)，其中， A-1和C-1表面非常光滑，而B-1的表面較粗糙。從斷面厚度可以看出，未處理的絲素膜和戊二醛交聯(lián)的絲素膜膜厚約40 μm，而乙醇表面處理的絲素膜略薄，在25 μm左右。這可能是由樣品膜不均勻所致。

圖3 不同方法處理后制得的絲素蛋白膜SEM照片(右上角為斷面形貌)

由圖4可知，在蛋白酶XIV降解液中浸泡16 d后，3種絲素膜的質(zhì)量下降幅度明顯，均比浸泡在PBS緩沖溶液中大，說明蛋白酶XIV能有效降解再生絲素蛋白膜材料。同時(shí)，在2種降解體系中，未經(jīng)處理的絲素膜的失重率最大，其次為添加戊二醛的絲素膜，而經(jīng)乙醇處理的絲素膜的失重率最小。這是因?yàn)榻到鈴姆墙Y(jié)晶區(qū)開始，無規(guī)線團(tuán)部分易被降解掉，而結(jié)晶區(qū)中的silkⅡ結(jié)構(gòu)則較難被降解，絲素膜中不同的結(jié)構(gòu)以及它們在材料中所占的比列對膜材料的降解速率有很大的影響[11]。添加戊二醛后，醛基與絲素分子形成共價(jià)交聯(lián)，增強(qiáng)了分子間作用力，無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)減少，silkⅡ的結(jié)晶結(jié)構(gòu)增加，因此其降解速度比未經(jīng)處理的絲素膜慢。而絲素膜經(jīng)乙醇表面處理后，蛋白構(gòu)象也由無規(guī)向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，且它的silkⅡ結(jié)構(gòu)所占比重可能比添加戊二醛的絲素膜要大，因此它的失重率在三者中最小。

圖4 絲素膜在降解過程中的質(zhì)量變化

對降解后絲素蛋白膜的構(gòu)象進(jìn)行紅外分析。由圖5可知，在蛋白酶XIV降解液中降解16 d后，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的特征吸收峰偏移到1 629、1 524 cm-1處。這是silkⅡ結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。 可見，降解以后，再生絲素蛋白膜的無定型區(qū)結(jié)構(gòu)含量減少，silkⅡ結(jié)構(gòu)含量增多。浸泡在PBS緩沖溶液中的絲素膜也有相同的變化趨勢。

圖5 降解后絲素膜的FTIR圖譜

圖6 絲素蛋白膜在PBS緩沖溶液和酶溶液中降解16 d后的SEM照片

降解后絲素蛋白膜的表面形貌發(fā)生了顯著變化。由圖6可知，絲素膜A-3在PBS緩沖溶液中降解16 d后，表面變得略微粗糙，斷面邊緣有少許裂紋，說明絲素膜的確發(fā)生了降解，且邊緣處降解較厲害。在蛋白酶XIV溶液中降解的絲素膜A-4則變化更為明顯，降解16 d后表面變得疏松，斷面邊緣也有更多的鋸齒狀降解紋。這說明蛋白酶XIV確實(shí)能加速降解絲素蛋白膜。經(jīng)乙醇處理的絲素膜也有此規(guī)律，且表面變化更顯著。在PBS溶液中降解的膜B-3表面呈現(xiàn)疏松結(jié)構(gòu)，在酶溶液中降解的膜B-4表面變成具有密集微孔結(jié)構(gòu)的粗糙表面，而它的失重率比未處理的絲素膜要小。這是因?yàn)閮烧叩慕到鈾C(jī)理不同，未處理的絲素膜在降解時(shí)是作為整體一起降解的，降解后的表面比較均一，在放大倍數(shù)較低的情況下觀察到的是較平整的表面；而經(jīng)乙醇表面處理過的絲素膜具有較多的silkⅡ結(jié)構(gòu)，其降解是從一些薄弱點(diǎn)開始的，很快形成一些裂縫，再慢慢往內(nèi)降解，因此它的表面會(huì)顯得更加粗糙。添加戊二醛的絲素膜C-3在PBS緩沖溶液中降解后表面仍比較光滑，斷面邊緣有比較突出的皺褶，說明該膜降解主要從邊緣開始。蛋白酶降解后的膜C-4表面變得疏松，但比未處理的略好。

3 結(jié)論與討論

蠶絲經(jīng)脫膠溶解后，采用流延干燥法可制得光滑致密的再生絲素蛋白膜。經(jīng)無水乙醇和濃度0.1%戊二醛不溶化處理后，絲素膜的力學(xué)性能得到提高，且分子中的β-折疊結(jié)構(gòu)增多，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)減少。鈷60-伽馬射線輻射滅菌對絲素分子的蛋白結(jié)構(gòu)有一定的影響，減少了絲素中的silkⅡ結(jié)構(gòu)，使得絲素的無規(guī)結(jié)構(gòu)稍有增加。另外，降解試驗(yàn)表明，蛋白酶XIV能降解再生絲素蛋白膜材料，降解16 d后絲素膜最大失重可達(dá)約60%。同時(shí)，經(jīng)無水乙醇表面處理的絲素膜失重率最小，其次為戊二醛處理的樣品，未處理的絲素膜失重率最大。該研究表明，通過合適的處理方法可以調(diào)整絲素蛋白膜的降解速度，以滿足其在子宮修復(fù)膜中的應(yīng)用要求。

[1] SCOTT-COOMBER D，WHAWELL S A，VIPOND M N,et al.Human intraperitoneal fibrinlytic response to surgery[J].Br J Surg,1995,82(3):414-418.

[2] ELLIS H.The clinical significance of abhesions: focus on intestinal obstruation[J].Eur J Surg,1997,577(S1):5-9.

[3] The Practice Co mmittee of the American Society for Reproductive Medicine . Control and prevention of peritoneal adhesions in gynecologic surgery[J]. Fertility and Sterility，2006,86(S1)：1-5.

[4] 羅軍.幾種手術(shù)防粘連材料的性能比較分析[J].中國醫(yī)療設(shè)備,2008,23(4):128-129.

[5] 陳艷雄,陳敏，朱譜新，等.絲素蛋白的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].紡織科技進(jìn)展,2007(2):13-18.

[6] 田娟,楊華.蠶絲不同溶解方法的研究[J].化學(xué)世界,2011,52(11):665-668.

[7] HORAN R L,ANTLE K,COLLETTE A L,et al. In vitro degradation of silk fibroin[J].Biomaterials 2005,26(17):3385-3393.

[8] 陳建勇,張加忠，馮新星，等.聚乳酸/絲素共混膜的制備及其性能[J].化工學(xué)報(bào),2008,59(3):773-777.

[9] 葉勇,張劍韻，黃龍全.甘油和戊二醛對絲素膜性能的改良效果[J].蠶業(yè)科學(xué),2006,32(2):231-235.

[10] 羅敏清.小分子多元醇對絲素蛋白結(jié)構(gòu)和性能的影響[D].蘇州：蘇州大學(xué),2011.

[11] 徐亞梅.絲素蛋白材料生物降解行為的研究[D].蘇州：蘇州大學(xué),2011.

Research on the Preparation and Properties of Regenerated Silk Fibroin Film

CHEN Yan et al

(Key Laboratory of Advanced Textile Materials and Manufacturing Technology of Ministry of Education, College of Materials and Textile, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou, Zhejiang 310018)

[Objective] Dense regenerated silk fibroin films were prepared. The films have good biocompatibility, appropriate mechanical property and regulated degradation velocity via optimal method of post-treatment. [Method]B.morisilk cocoons were degummed and solubilized to obtain regenerated silk solution, and then regenerated silk films were fabricated using tape-casting method. Pure ethanol solution and 0.1% glutaraldehyde were selected to improve cross-linking of SF molecular. SF degradation experiment was carried out in protease XIV solution. The microstructure, protein conformation and degradability, mechanical property of regenerated SF films were characterized using FESEM, FTIR, weight-loss method and Instron Tensile Machine etc. [Result] Obtained SF films were smooth and dense, the β-sheet conformation content of SF films increased and random coil conformation content decreased after treatment by pure ethanol and glutaraldehyde. Both modified SF films had higher mechanical properties and slower degradation speed. [Conclusion] Silk fibroin film was a potential biomedical barrier as anti-adhesive materials to reduce the presence and extent of intrauterine adhesions.

Silk fibroin films; Conformation; Enzymatic degradation

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51202219)；浙江省錢江人才計(jì)劃項(xiàng)目(2013R10062)。

陳燕(1991- )，女，浙江平湖人，本科生，專業(yè)：材料科學(xué)與工程。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事生物礦化及醫(yī)用材料方面的研究。

2014-05-01

S 188

A

0517-6611(2014)17-05355-03