基于細(xì)胞3D打印技術(shù)的腫瘤藥物篩選細(xì)胞芯片研究

趙占盈 徐銘恩 石 然 郭 淼 嚴(yán) 明 徐 瑩 王 玲

(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院， 杭州 310018)

基于細(xì)胞3D打印技術(shù)的腫瘤藥物篩選細(xì)胞芯片研究

趙占盈 徐銘恩*石 然 郭 淼 嚴(yán) 明 徐 瑩 王 玲

(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院， 杭州 310018)

現(xiàn)有的藥物篩選評(píng)價(jià)技術(shù)中，動(dòng)物篩選模型存在種屬差異和周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，高通量篩選和細(xì)胞篩選模型則與體內(nèi)環(huán)境差異大，藥物篩選準(zhǔn)確率低。細(xì)胞3D打印技術(shù)為在體外構(gòu)建仿真的組織器官模型提供了可能，當(dāng)其與細(xì)胞芯片技術(shù)結(jié)合則為體外構(gòu)建高效準(zhǔn)確的藥物篩選模型提供了新的技術(shù)空間。本研究構(gòu)建了含有多個(gè)叉指電極(IDEs)陣列的細(xì)胞芯片，用細(xì)胞3D打印技術(shù)在芯片上組裝了卵巢癌細(xì)胞HO-8910和人肝間充質(zhì)干細(xì)胞HMSC-H組織模型，并通過對(duì)組織模型內(nèi)細(xì)胞阻抗變化的檢測(cè)，反映細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附、增殖、凋亡的過程及藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響等，最終基于該模型檢測(cè)了抗癌藥物順鉑和環(huán)磷酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和肝毒性。結(jié)果顯示：支架微絲直徑和孔徑約為200～300 μm，腫瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)里生長(zhǎng)良好；DMEM作為電解液，芯片在104Hz可準(zhǔn)確檢測(cè)到三維結(jié)構(gòu)中細(xì)胞增殖引起的阻抗變化，20 h后阻抗升高69.6%；基于該篩選模型，能同步檢測(cè)到藥物的抗腫瘤作用和肝毒性，并篩選出需要肝的二次代謝產(chǎn)物才能產(chǎn)生抗腫瘤性的藥物環(huán)磷酰胺。

細(xì)胞3D打印；細(xì)胞芯片；藥物篩選；叉指電極；支架

引言

近年來，隨著3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展，在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。目前，研究者已經(jīng)開發(fā)出多種可以將細(xì)胞材料打印成三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。如：細(xì)胞打印技術(shù)(Cell printing)[1]、生物3D打印技術(shù)(3D-Bioplotter)[2]以及本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出的細(xì)胞3D打印技術(shù)(3D cell printing)[3]，可操控活細(xì)胞，打印出利于細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、遷移和分化的三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞3D打印技術(shù)已可以在體外構(gòu)建復(fù)雜的類組織和器官，為生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域拓展了新的理論和技術(shù)可能。在藥物篩選領(lǐng)域，現(xiàn)有的動(dòng)物篩選模型存在種屬差異和周期長(zhǎng)等缺陷，而高通量篩選技術(shù)則與體內(nèi)環(huán)境差異大，導(dǎo)致篩選準(zhǔn)確率低。細(xì)胞3D打印為在體外用人體細(xì)胞構(gòu)建復(fù)雜的多組織系統(tǒng)藥物篩選模型提供了可能。本實(shí)驗(yàn)室的研究也證明，可用細(xì)胞3D打印技術(shù)構(gòu)建更準(zhǔn)確的藥物篩選模型[3]。但是如何實(shí)時(shí)、高通量和無損檢測(cè)這種類組織系統(tǒng)信號(hào)變化，是其用于高通量藥物篩選亟待解決的問題。

細(xì)胞芯片是通過將芯片與細(xì)胞結(jié)合，在芯片上完成對(duì)細(xì)胞控制和檢測(cè)生理變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞實(shí)時(shí)、高通量、原位信號(hào)檢測(cè)的技術(shù)[4-6]。近年來，細(xì)胞芯片正逐步從“cell on chip”向“Tissue model, living system on chip”發(fā)展，即在芯片上構(gòu)建復(fù)雜的組織、器官模型[7-10]。如Harvard大學(xué)的Ingber DE[11]和Cornell大學(xué)的Sung JH[12]分別在芯片上構(gòu)建了微組織模型，研究顯示在藥物領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而，如何將不同細(xì)胞精確定位裝配到芯片上并形成功能組織結(jié)構(gòu)，是目前在芯片表面構(gòu)建組織模型尚待解決的問題。細(xì)胞3D打印技術(shù)是構(gòu)建組織模型芯片最具潛力的技術(shù)，其與細(xì)胞芯片技術(shù)的結(jié)合，為構(gòu)建準(zhǔn)確、高效、高通量的多組織系統(tǒng)藥物篩選模型提供了可能。

本研究提出用細(xì)胞3D打印和細(xì)胞芯片技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)包括腫瘤和肝組織的體外腫瘤藥物篩選模型芯片。藥物在體內(nèi)的作用過程涉及多個(gè)組織和器官，其中最關(guān)鍵的是靶組織和藥物代謝組織。肝組織對(duì)藥物的代謝不但影響藥物的清除時(shí)間，代謝產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物有時(shí)也是產(chǎn)生藥效的關(guān)鍵，而藥物的肝毒性則構(gòu)成了藥物的主要副作用[13-14]。本研究首先設(shè)計(jì)制造含多個(gè)IDEs陣列的細(xì)胞芯片；然后選擇不影響細(xì)胞電生理檢測(cè)的生物材料固定細(xì)胞；通過對(duì)比鐵氰化鉀溶液、PBS溶液和DMEM三種電解液對(duì)細(xì)胞阻抗變化的檢測(cè)，選擇合適的電解液及阻抗測(cè)試頻段；用細(xì)胞3D打印技術(shù)在芯片表面組裝卵巢癌細(xì)胞HO-8910，檢測(cè)細(xì)胞貼壁、遷移、增殖等引起的阻抗變化，并與生化檢測(cè)法(Alamar blue)的結(jié)果作比照；最后，在由兩組IDEs構(gòu)建的循環(huán)系統(tǒng)中組裝人肝間充質(zhì)干細(xì)胞HMSC-H和HO-8910，并檢測(cè)順鉑DDP和環(huán)磷酰胺CTX的抗腫瘤作用及肝毒性。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞3D打印平臺(tái)

圖1 細(xì)胞3D打印技術(shù)。(a) 生物3D打印機(jī)；(b) 生物3D打印機(jī)系統(tǒng)圖Fig.1 3D cell printing technique. (a) 3D cell printing device; (b) System diagram of 3D cell printing device

細(xì)胞3D打印技術(shù)是基于離散/堆積原理，在計(jì)算機(jī)的控制下，以活細(xì)胞為操控對(duì)象，按照預(yù)先構(gòu)建的3D模型準(zhǔn)確定位與輸送細(xì)胞材料復(fù)合物。本研究使用的細(xì)胞3D打印平臺(tái)是一款本團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的生物3D打印機(jī)(Regenovo，杭州捷諾飛生物科技有限公司)。圖1(a)即為所用的生物3D打印機(jī)，圖1(b)是生物3D打印機(jī)系統(tǒng)圖。

該生物3D打印機(jī)成型系統(tǒng)包括軟件系統(tǒng)、硬件系統(tǒng)2個(gè)部分。軟件系統(tǒng)包括數(shù)據(jù)處理軟件和系統(tǒng)控制軟件，能精確控制打印過程。硬件系統(tǒng)分為控制系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng)，控制系統(tǒng)包括運(yùn)動(dòng)控制卡、溫度控制系統(tǒng)以及材料運(yùn)輸控制電路等硬件電路；機(jī)械系統(tǒng)包括四軸運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、制冷模塊等。四軸運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中，3個(gè)伺服電機(jī)控制噴頭在X/Y/Z方向的精確定位，一個(gè)步進(jìn)電機(jī)控制材料擠出。

1.2細(xì)胞芯片的設(shè)計(jì)和制造

細(xì)胞電阻抗傳感器(electric cell-substrate impedance sensor, ECIS)是一種能夠同時(shí)測(cè)量多組不同細(xì)胞的電阻變化、膜電容變化，以及細(xì)胞層-基底膜空間變化的細(xì)胞生理與病理研究的細(xì)胞傳感器。通過微安級(jí)的電流測(cè)量，可以實(shí)時(shí)連續(xù)地量化研究細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞增殖之間的相互作用，測(cè)量貼壁細(xì)胞遷移過程中的細(xì)胞形態(tài)變化[15]。其測(cè)量原理如圖2 所示，細(xì)胞的貼附、伸展、黏連、增殖和凋亡等都會(huì)影響阻抗值。

圖2 阻抗隨細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)改變而變化Fig.2 Impedance varies with the cell number and morphology

本研究選取了ECIS中研究較多的叉指電極(interdigitated electrodes，IDEs)作為芯片表面?zhèn)鞲衅鳌DEs具有高通量、微型化、靈敏度高和信噪比好等優(yōu)點(diǎn)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞芯片公司合作，采用了集成八組IDEs陣列的細(xì)胞芯片，每四組為一個(gè)單元，兩個(gè)單元相互獨(dú)立，每組IDEs都能打印不同的細(xì)胞，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、毒性、粘附及形態(tài)變化等生物學(xué)反應(yīng)過程。圖3(a)為單組叉指電極設(shè)計(jì)圖，圖3(b)為叉指電極區(qū)放大圖。

在該設(shè)計(jì)中，每組叉指陣列有62對(duì)叉指電極，分為兩部分，間距1mm，便于在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。電極間距約為30 μm，矩形區(qū)電極長(zhǎng)度為6 mm，單個(gè)叉指采用“圓在線上”的串珠狀結(jié)構(gòu)，圓的直徑約為95 μm，增大了電極面積和細(xì)胞貼附到電極上的概率，能夠更靈敏地監(jiān)測(cè)活細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

圖3 細(xì)胞芯片圖。(a) 單組叉指電極示意圖；(b) 叉指電極局部放大圖Fig.3 The cell chip. (a) The schematic illustration of a group of IDEs; (b) A local enlarged photo of (a)

本研究還采用了一款之前設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)梳狀叉指電極作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每組叉指陣列有30對(duì)叉指電極，單個(gè)叉指寬度及電極間距均為30 μm，長(zhǎng)度為0.9 mm，如圖4。

圖4 傳統(tǒng)梳狀叉指電極Fig.4 Traditional comb-like electrodes

1.3基質(zhì)材料的制備及支架的打印

基于對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的仿生、材料成型特性和細(xì)胞電生理檢測(cè)技術(shù)需求[19-21]，本研究選取明膠和海藻酸鈉(Sigma, USA)為基質(zhì)材料。取2 mg明膠和2 mg海藻酸鈉，各溶于10 mL超純水。將兩種材料按1∶1混合均勻，4℃保存。

人肝間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells-hepatic, HMSC-H)用DMEM-LG(dulbecco’s modified eagle’s medium -low glucose, Sigma, USA)培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及2 mM谷氨酰胺，3～4 d換液一次，細(xì)胞匯合后，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)[22]。卵巢癌細(xì)胞系HO-8910細(xì)胞用DMEM(dulbecco’s modified eagle’s medium,Sigma, USA)+10%胎牛血清培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，2～3 d細(xì)胞達(dá)到單層匯合，細(xì)胞匯合后，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)[23]。實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)的細(xì)胞和基質(zhì)材料混合，得到濃度約為1×106/mL的細(xì)胞-基質(zhì)材料。

將噴頭及成型平臺(tái)溫度降至4℃，將細(xì)胞-材料共混物吸入噴射腔，選用120 μm的噴頭。用SolidWorks設(shè)計(jì)三維模型，在生物3D打印機(jī)控制軟件3D-Bioprint內(nèi)加載三維模型，設(shè)置合適的高度、速度、層厚、輪廓等相關(guān)參數(shù)，對(duì)3D模型進(jìn)行分層處理生成G-code文件。3D-Bioprint讀取G-code文件，按照設(shè)定的成型參數(shù)直接驅(qū)動(dòng)噴頭在芯片表面組裝出三維結(jié)構(gòu)。成型后使用5%的CaCl2溶液交聯(lián)；加含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。

1.4芯片測(cè)試

研究使用電化學(xué)站(上海辰華CHI660c)和實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀(艾森生物iCELLigenceTM)對(duì)芯片進(jìn)行電化學(xué)交流阻抗測(cè)試[15,24-26]。以pH為7.2的鐵氰化鉀溶液(含1.0 mL濃度為0.1 M的鐵氰化鉀[Fe(CN)6]3-溶液、1.0 mL濃度為0.1 M的亞鐵氰化鉀[Fe(CN)6]4-溶液和8 mL PBS溶液)為標(biāo)準(zhǔn)電解液體系。分別在以下4種情況下測(cè)試IDEs電極的阻抗[27]:

(1)pH為7.2的鐵氰化鉀溶液作為電解液。

(2)純PBS溶液作為電解液。

(3)不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為電解液。

(4)不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為電解液，并在芯片表面打印基質(zhì)材料。

多細(xì)胞阻抗測(cè)試系統(tǒng)原理圖如5(a)。圖中A、B兩個(gè)連通的培養(yǎng)腔底部均有一組IDEs，腔內(nèi)液體的循環(huán)流通由微蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)，兩組IDEs表面可以分別組裝肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。圖5(b)顯示為單個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)的細(xì)胞/材料支架放置圖，支架沿液體流動(dòng)方向存在通道，保證細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)和排泄廢物。圖5(c)為改裝后的芯片實(shí)物圖。支架底部與芯片表面部分接觸，細(xì)胞在初期只能粘附在芯片與支架接觸的區(qū)域，細(xì)胞向非接觸區(qū)電極的增殖、遷移形成阻抗的變化，如圖5中(d)和(e)所示。IDEs用作阻抗測(cè)試時(shí)主要采用兩電極電路，即工作電極和對(duì)電極，由于二者的尺寸相同，細(xì)胞對(duì)總阻抗測(cè)量的貢獻(xiàn)在任何位置上都等同，從而減少了大量溶液阻抗的影響。電化學(xué)站的工作電極連接IDEs的一端，參比電極和對(duì)電極與IDEs另一端相連，電化學(xué)站既可以在1 Hz～100 kHz頻率范圍內(nèi)測(cè)量交流阻抗變化，也能在固定頻率下進(jìn)行阻抗-時(shí)間測(cè)試。細(xì)胞芯片放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以避免測(cè)試過程中受到外部環(huán)境變化的影響。開路電位下測(cè)量電化學(xué)阻抗譜，金電極的開路電位Ewe=0.20 V。測(cè)量數(shù)據(jù)密度為12 points/decade(10倍頻率范圍內(nèi)取12個(gè)頻率點(diǎn))，每個(gè)頻率點(diǎn)測(cè)量次數(shù)為2，交流電壓幅值為5 mV，頻率范圍為1 Hz～100 kHz。

圖5 細(xì)胞阻抗測(cè)試系統(tǒng)。 (a) 多細(xì)胞阻抗測(cè)試；(b) 芯片改裝實(shí)物圖；(c) 單個(gè)腔內(nèi)支架放置圖；(d) 支架內(nèi)細(xì)胞在芯片表面生長(zhǎng)圖；(e)細(xì)胞生長(zhǎng)局部圖Fig.5 Cell impedance measuring system. (a) Multicellular impedance measurement; (b) Retrofit of cell chip; (c) A scaffold placed in a chamber; (d) Cells in the scaffold grew on the surface of cell chip; (e) A local enlarged photo of (d)

2 結(jié)果

為了給細(xì)胞提供一個(gè)更接近體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，本研究模仿人體組織器官的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)出三維模型，并將細(xì)胞-基質(zhì)材料在芯片表面組裝成型。通過構(gòu)建三維模型、設(shè)置分層參數(shù)和修改掃描路徑，能夠打印出外形輪廓和內(nèi)部微通道形狀各異的支架結(jié)構(gòu)，如圖6所示。圖6中(a)和(b)分別是微通道為四邊形和三角形的支架，圖6(c)為四邊形微通道顯微鏡圖片，圖6(d)為細(xì)胞免疫熒光染色圖。由圖可以看出，打印的支架微通道結(jié)構(gòu)清晰，四邊形微通道結(jié)構(gòu)的微絲直徑在200～300 μm，小孔尺寸約200 μm，孔隙率可以達(dá)到60%。熒光顯微鏡顯示細(xì)胞能在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)生長(zhǎng)、鋪展。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，借助細(xì)胞3D打印，可以將細(xì)胞/基質(zhì)材料組裝形成三維模型，且細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)生長(zhǎng)良好。為了選取合適的電解液及測(cè)試頻段，以及驗(yàn)證基質(zhì)材料對(duì)芯片測(cè)試的影響，分別選取pH為7.2的鐵氰化鉀溶液、純PBS溶液和不含胎牛血清的DMEM作為測(cè)試電解液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7。結(jié)果顯示IDEs在pH為7.2的鐵氰化鉀溶液中的測(cè)試結(jié)果最為理想，在低頻區(qū)(1～100 Hz)DMEM和PBS溶液的交流阻抗特性呈容性。這是由于鐵氰化鉀溶液中有導(dǎo)電離子[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-，而DMEM和PBS中缺乏強(qiáng)導(dǎo)電離子。所以在細(xì)胞測(cè)試條件允許的情況下，應(yīng)優(yōu)先采用鐵氰化鉀溶液進(jìn)行測(cè)試。

然而為了長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞活性，就需要采用PBS和DMEM等非電解液溶液作為測(cè)試液。由圖7結(jié)果顯示，在中高頻區(qū)(1 k～100 kHz)DMEM與鐵氰化鉀溶液的電阻抗特性相似，其原始阻抗低于PBS溶液的原始阻抗，且DMEM更適合細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)，將DMEM作為電解液研究其特性。結(jié)果如圖8所示，在適合細(xì)胞電生理阻抗測(cè)試的中高頻區(qū)(1 k～100 kHz)，加入基質(zhì)材料前后，幅頻特性曲線和相頻特性曲線變化均不明顯，且相頻特性與pH為7.2的鐵氰化鉀溶液基本一致。實(shí)驗(yàn)證明：明膠/海藻酸鈉混合材料對(duì)阻抗測(cè)試影響甚??；在中高頻區(qū)，DMEM能替代鐵氰化鉀溶液作為長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試電解液；細(xì)胞阻抗測(cè)試時(shí)，中高頻區(qū)能檢測(cè)出細(xì)胞膜等有機(jī)物引起的電極表面容性阻抗的變化，且具有較好的靈敏度。

圖6 細(xì)胞/基質(zhì)材料支架結(jié)構(gòu)。(a) 四邊形通道的支架；(b) 三角形通道的支架；(c) 四邊形微通道支架顯微照；(d) 免疫熒光染色Fig.6 Structures of cell/materials scaffolds. (a) Scaffold with square microchannels; (b) Scaffold with triangular microchannels; (c) Micrograph of square microchannels; (d) Immunofluorescence staining

圖7 叉指電極在3種溶液中測(cè)試數(shù)據(jù)的疊加圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(a) 幅頻特性；(b) 相頻特性Fig.7 Measurement of IDEs in three kinds of solution. (n=3). (a) Impedance modulus of frequency; (b) Phase of frequency

圖8 叉指電極在DMEM中測(cè)得數(shù)據(jù)的疊加圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(a) 幅頻特性；(b)相頻特性Fig.8 Measurement of IDEs in DMEM solution (n=3). (a) Impedance modulus of frequency; (b) Phase of frequency

圖9 串珠型電極與梳狀電極對(duì)比Fig.9 A comparison of circle-on-line electrodes with comb-like electrodes

本研究比較了串珠型叉指電極和傳統(tǒng)梳狀叉指電極的檢測(cè)效果。以104Hz作為測(cè)試頻率，結(jié)果顯示(如圖9所示)，串珠型叉指電極比梳狀叉指電極的原始阻抗更低、靈敏度更好。由于用于固定細(xì)胞的基質(zhì)材料會(huì)影響細(xì)胞阻抗變化檢測(cè)的靈敏性，因此選用原始阻抗更低、靈敏度更好的串珠型叉指電極更利于打印細(xì)胞的阻抗檢測(cè)。

為驗(yàn)證IDEs能否檢測(cè)出細(xì)胞/材料組裝結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的阻抗變化，本研究在芯片表面組裝了HO-8910細(xì)胞，并研究IDEs檢測(cè)到的細(xì)胞增殖。組裝完成后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，然后將IDEs與電化學(xué)站相連，在104Hz進(jìn)行阻抗-時(shí)間測(cè)試，連續(xù)監(jiān)測(cè)20 h，分別在0、5、10、15、20 h時(shí)間點(diǎn)采樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各時(shí)間點(diǎn)Tn的檢測(cè)值和T0時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)值的比值來表示(fold increase)，同時(shí)用生化檢測(cè)法(Alamar blue)做平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。由圖10可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HO-8910細(xì)胞在芯片上貼壁、伸展和增殖，芯片監(jiān)測(cè)到的阻抗值持續(xù)增加，但增加幅度減慢，這和細(xì)胞在材料內(nèi)接觸抑制達(dá)到生長(zhǎng)極限有關(guān)，這一檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)的生化檢測(cè)方法測(cè)得數(shù)據(jù)一致[28]。結(jié)果證明，在芯片表面組裝了細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)后，芯片可以準(zhǔn)確檢測(cè)出貼壁細(xì)胞增殖。

圖10 分別用芯片和Alamar Blue 法檢測(cè)獲得的芯片表面HO-8910增殖曲線(增殖速率用Tn/T0表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)Fig.10 Proliferation of HO-8910 cell were expressed as the celluar impedance and Alamar Blue assay (Fold increase is represented by Tn/T0, n=3)

藥物在體內(nèi)的作用過程涉及多個(gè)組織和器官，其中最關(guān)鍵的是靶組織和代謝組織。肝組織對(duì)藥物的代謝不但影響藥物清除時(shí)間，二次代謝產(chǎn)物有時(shí)也是產(chǎn)生藥效的關(guān)鍵，而藥物的肝毒性則構(gòu)成了藥物的主要副作用?；诖?，本研究構(gòu)建了一個(gè)含有靶組織-腫瘤組織、代謝組織-肝組織的腫瘤藥物篩選模型芯片。如圖5(a)所示，在A、B兩個(gè)培養(yǎng)腔底的IDEs上分別組裝人肝間充質(zhì)干細(xì)胞HMSC-H和卵巢癌細(xì)胞HO-8910。組裝完成后，培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)電阻抗測(cè)試。兩種抗癌藥物順鉑DDP和環(huán)磷酰胺CTX分別滴加到組裝了肝細(xì)胞的培養(yǎng)腔內(nèi)，并在0、1、2、3、4 h時(shí)間點(diǎn)同步采樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各時(shí)間點(diǎn)Tn的檢測(cè)值和T0時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)值的比值來表示(fold increase)。

圖11 順鉑和環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用和肝毒性(變化率用Tn/T0表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)Fig.11 The antitumor effect and hepatoxicity of DDP and CTX (Represented by Tn/T0, n=3)

由圖11可見，芯片可以同步檢測(cè)到抗癌藥物對(duì)HMSC-H和HO-8910的作用。結(jié)果表明，兩種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞都有殺傷作用，對(duì)肝細(xì)胞都有不同程度的損傷。加入順鉑0～2 h內(nèi)，卵巢癌細(xì)胞的阻抗下降顯著，說明順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的殺傷效果。環(huán)磷酰胺本身并無抗腫瘤活性，但在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝產(chǎn)生活性產(chǎn)物磷酰胺氮芥和丙烯醛，磷酰胺氮芥能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，丙烯醛則具有肝毒性。因此環(huán)磷酰胺對(duì)兩種細(xì)胞的損傷都取決于肝細(xì)胞對(duì)藥物的代謝。加入藥物1 h內(nèi)，由于肝細(xì)胞分解代謝環(huán)磷酰胺形成的磷酰胺氮芥及丙烯醛濃度尚低，藥物對(duì)兩種細(xì)胞的損傷作用較小，隨著二次代謝物的逐漸積累，對(duì)肝細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的損傷效果逐漸增強(qiáng)，3 h后超過順鉑的抗腫瘤效果，對(duì)肝臟的毒性也逐漸增強(qiáng)，2 h后肝毒性也大于順鉑。

3 討論和結(jié)論

如何將不同細(xì)胞精確定位裝配到芯片表面，是制約細(xì)胞芯片向組織和生理系統(tǒng)芯片方向發(fā)展的關(guān)鍵問題之一，細(xì)胞3D打印技術(shù)能夠準(zhǔn)確定位與輸送細(xì)胞材料，為解決這一問題提供了可能。本研究通過細(xì)胞3D打印技術(shù)將細(xì)胞水凝膠材料組裝到芯片表面，并對(duì)支架內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行阻抗檢測(cè)。用于混合和固定細(xì)胞的材料對(duì)芯片檢測(cè)的影響是研究關(guān)鍵。本研究選取明膠/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠材料，結(jié)果顯示，芯片在中高頻區(qū)(1 k～100 kHz)能檢測(cè)出細(xì)胞阻抗變化，證明可用水凝膠材料作為打印基質(zhì)固定細(xì)胞并保證芯片對(duì)細(xì)胞檢測(cè)的靈敏性。其原理是因?yàn)樗z材料具有較高的含水量，對(duì)電解液中離子有良好的滲透性，從而使基質(zhì)材料對(duì)阻抗檢測(cè)影響小，保證了細(xì)胞電生理檢測(cè)的靈敏度。

本研究將3D組織模型與芯片表面粘附的細(xì)胞層作為采樣面，進(jìn)行實(shí)時(shí)阻抗檢測(cè)。細(xì)胞增殖測(cè)試結(jié)果證明，芯片檢測(cè)結(jié)果與檢測(cè)全3D組織細(xì)胞生長(zhǎng)情況的生化檢測(cè)結(jié)果一致。然而，盡管平面芯片檢測(cè)方法能夠在一定條件下反映出細(xì)胞在整個(gè)3D結(jié)構(gòu)內(nèi)的生長(zhǎng)狀況，但在一些特殊的三維組織結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞在不同空間結(jié)構(gòu)位置會(huì)有不同的生長(zhǎng)特性和信號(hào)變化，單個(gè)面的信號(hào)檢測(cè)不能反映出整個(gè)3D模型及特定空間位置的生理變化。因此，如要全面、準(zhǔn)確的反映3D組織模型內(nèi)的生理生化變化，還需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步開發(fā)出具有三維檢測(cè)單元的三維細(xì)胞芯片。

在藥物篩選領(lǐng)域，現(xiàn)有的動(dòng)物篩選模型存在種屬差異和周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，高通量篩選和細(xì)胞篩選模型則與體內(nèi)環(huán)境差異大，藥物篩選準(zhǔn)確率低。在體外構(gòu)建更接近體復(fù)雜的組織、器官模型用于藥物篩選正成為研究熱點(diǎn)[9,29-30]。細(xì)胞3D打印技術(shù)與細(xì)胞芯片技術(shù)結(jié)合為體外構(gòu)建高效準(zhǔn)確的藥物篩選模型提供了可能。本研究用細(xì)胞3D打印技術(shù)在芯片上同時(shí)組裝了肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，構(gòu)建一個(gè)體外三維篩選模型，并對(duì)順鉑和環(huán)磷酰胺的藥效進(jìn)行研究。結(jié)果顯示基于該篩選模型，能同步檢測(cè)到藥物的抗腫瘤作用和肝毒性，并篩選出需要肝的二次代謝產(chǎn)物才能產(chǎn)生抗腫瘤特性的藥物環(huán)磷酰胺。

本研究證明了細(xì)胞3D打印技術(shù)與細(xì)胞芯片技術(shù)結(jié)合，可以構(gòu)建出準(zhǔn)確、高效、高通量的多組織系統(tǒng)藥物篩選模型芯片，并可以高效準(zhǔn)確地篩選出藥物。

[1] Cui Xiaofeng, Dean D, Ruggeri ZM,etal. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 106(6): 963-969.

[2] Kampmann A, Lindhorst D, Schumann P,etal. Additive effect of mesenchymal stem cells and VEGF to vascularization of PLGA scaffolds[J]. Microvascular Research, 2013, 90: 71-79.

[3] Xu Mingen, Wang Xiaohong, Yan Yongnian,etal. An cell-assembly derived physiological 3D model of the metabolic syndrome, based on adipose-derived stromal cells and a gelatin/alginate/fibrinogen matrix [J]. Biomaterials, 2010,31(14):3868-3877.

[4] Wang Jun, Wu Chengxiong, Hu Ning,etal. Microfabricated electrochemical cell-based biosensors for analysis of living cellsinvitro[J]. Biosensors, 2012,2(2): 127-170.

[5] Koester PJ, Buehler SM, Stubbe M,etal. Modular glass chip system measuring the electric activity and adhesion of neuronal cells—application and drug testing with sodium valproic acid[J]. Lab on a Chip, 2010,10(12): 1579-1586.

[6] Liu Zongbin, Zhang Yu, Yu Jinjiang,etal. A microfluidic chip with poly (ethylene glycol) hydrogel microarray on nanoporous alumina membrane for cell patterning and drug testing[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010,143(2): 776-783.

[7] Baker M. Tissue models: a living system on a chip [J]. Nature, 2011,471(7340):661-665.

[8] van der Meer AD, van den Berg A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse[J]. Integrative Biology, 2012,4(5): 461-470.

[9] Ghaemmaghami AM, Hancock MJ, Harrington H,etal. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery[J]. Drug Discovery Today, 2012,17(3): 173-181.

[10] Moraes C, Mehta G, Lesher-Perez SC,etal. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices[J]. Annals of Biomedical Engineering, 2012,40(6): 1211-1227.

[11] Huh D, Matthews BD, Mammoto A,etal. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010 Jun 25，328(5986):1662-8.

[12] Sung JH, Kam C, Shuler ML. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 2010 Feb 21;10(4):446-55.

[13] Fan Jianghong, Chen Shu, Edwin CYC,etal. PBPK modeling of intestinal and liver enzymes and transporters in drug absorption and sequential metabolism[J]. Current Drug Metabolism, 2010,11(9): 743-761.

[14] Wang Jingfang, Chou Kuochen. Molecular modeling of cytochrome P450 and drug metabolism[J]. Current Drug Metabolism, 2010,11(4): 342-346.

[15] 鄭波，劉清君，曾蘇. 微電子細(xì)胞傳感器在抗腫瘤藥物分析中的應(yīng)用研究[J]. 傳感器與微系統(tǒng), 2012,31(4): 40-42.

[16] 顏小飛，汪懋華，安冬. 基于叉指陣列微電極的阻抗免疫傳感器研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué) (FENXI HUAXUE), 2011,39(10):1601-1610.

[17] Singh KV, Whited AM, Ragineni Y,etal. 3D nanogap interdigitated electrode array biosensors[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010,397(4): 1493-1502.

[18] Eker B, Meissner R, Bertsch A,etal. Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells[J]. PloS One, 2013,8(3): e57423.

[19] Helgeson ME, Chapin SC, Doyle PS. Hydrogel microparticles from lithographic processes: Novel materials for fundamental and applied colloid science[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2011,16(2): 106-117.

[20] Geckil H, Xu Feng, Zhang Xiaohui,etal. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics[J]. Nanomedicine, 2010,5(3): 469-484.

[21] Pataky K, Braschler T, Negro A,etal. Microdrop printing of hydrogel bioinks into 3D tissue-like geometries[J]. Advanced Materials, 2012,24(3): 391-396.

[22] Bartosh TJ, Yl?stalo JH, Mohammadipoor A,etal. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010,107(31): 13724-13729.

[23] Sun Yao, Mu Fansong, Li Chunying,etal. Aspidin BB, a phloroglucinol derivative, induces cell cycle arrest and apoptosis in human ovarian HO-8910 cells[J]. Chemico-Biological Interactions, 2013,204(2): 88-97.

[24] 徐瑩. 基于 MEMS 技術(shù)的新型細(xì)胞傳感器及其在細(xì)胞電生理中應(yīng)用的研究[D]. 浙江: 浙江大學(xué), 2007.

[25] 胡朝穎，劉清君，張遠(yuǎn)帆，等. 細(xì)胞阻抗傳感器優(yōu)化設(shè)計(jì)及其在毒素監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào), 2010,23(3): 291-296.

[26] Ge Yakun, Deng Tongle, Zheng Xiaoxiang. Dynamic monitoring of changes in endothelial cell-substrate adhesiveness during leukocyte adhesion by microelectrical impedance assay[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2009,41(3): 256-262.

[27] 胡金夫，徐銘恩，徐瑩，等. 基于細(xì)胞三維受控組裝技術(shù)的細(xì)胞芯片構(gòu)建[J]. 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào), 2012,31(3): 374-381.

[28] Jomha NM, Elliott JA, Law GK,etal. Evaluation of chondrocyte survival in situ using WST-1 and membrane integrity stains [J]. Cell and Tissue Banking, 2007,8(3):179-186.

[29] Klo? D, Fischer M, Rothermel A,etal. Drug testing on 3Dinvitrotissues trapped on a microcavity chip[J]. Lab on a Chip, 2008,8(6): 879-884.

[30] Neu?i P, Giselbrecht S, L?nge K,etal. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2012,11(8): 620-632.

ResearchofAnti-TumorDrugScreeningCellChipBasedon3DCellPrintingTechnique

ZHAO Zhan-Ying XU Ming-En*SHI Ran GUO Miao YAN Ming XU Ying WANG Ling

(CollegeofLifeIinformationScience&InstrumentEngineering,HangZhouDianZiUniversity,Hangzhou310018,China)

There are some crucial problems in conventional drug screening systems. For example, animal models have shortcomings of species differences and long test periods; in addition, poor mimics ofinvivomicroenvironment results in the low accuracy of cell-based high-throughput drug screening assays. The 3D cell printing technology may provide solutions of establishing biomimetic tissue modelsinvitro. Moreover, the combination of 3D cell printing and cell chip provides a highly valuable tool for the efficient and accurate drug screeninginvitro. In this study, a cell chip integrating several groups of IDEs, was designed and manufactured. Then, the HMSC-H and HO-8910 cell lines were assembled within the gelatin/alginate mixture on the manufactured chip using 3D cell printing. The IDEs was used to detect changes in the cell impedance which reflects the cell growth, adhesion, proliferation, apoptosis and effects of drugs on the viability. Based on this cells-loaded chip, the antitumor effect or hepatoxicity of both CTX and DDP were measured respectively. Our results showed that the 3D structure could suppot the growth of HMSC-H or HO-8910 cells. The scaffold possessed pores with diameter of 200-300 μm. The change of impedance caused by the cell proliferation was precisely detected by the chip at 104Hz using DMEM as electrolyte solution, 20 h later, the cell impedance increased by 69.6%. Using this chip-based in vitro drug screening model, we simultaneously detected the antitumor effect and hepatotoxicity of the drugs. Meanwhile, the efficacy of these drugs, which require hepatic metabolism for activation such as CTX, was also evaluated in the same chip.

3D cell printing; cell chip; drug screening; IDEs; scaffold

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 02.005

2013-11-30， 錄用日期:2014-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371695, 61108083)；浙江省科技計(jì)劃(2011C23031)

R318

A

0258-8021(2014) 02-0161-09

*通信作者。E-mail: xumingen@hdu.edu.cn