慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

張斌，張喬，馬英男

(1.哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 哈爾濱 150525;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076)

人的一生大約有1/3的時(shí)間是在睡眠中度過的，所以睡眠的質(zhì)量對(duì)維持機(jī)體健康狀態(tài)至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和工作壓力的日益增大，在臨床上常見由應(yīng)激所導(dǎo)致的各種疾病［1］，且已有文獻(xiàn)研究表明，慢性應(yīng)激會(huì)對(duì)整個(gè)睡眠結(jié)構(gòu)造成影響［2］。慢性束縛應(yīng)激是使嚙齒類動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激的經(jīng)典方法，國(guó)外已有慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相影響的文獻(xiàn)報(bào)道［3］。然而目前國(guó)內(nèi)慢性束縛應(yīng)激的研究主要集中在模型復(fù)制后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)研究和生化指標(biāo)含量的測(cè)定上［4］，未見采用多導(dǎo)生理描記技術(shù)研究其對(duì)睡眠時(shí)相影響的報(bào)道。酸棗仁湯出自《金匱要略》，主治“虛煩不眠”，是目前中醫(yī)臨床上常用的治療失眠的經(jīng)典基礎(chǔ)方。

基于以上，本研究采用大鼠皮層腦電、肌電描記技術(shù)來(lái)考察慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相的影響，并在本課題組前期研究的基礎(chǔ)之上，探討了酸棗仁湯對(duì)慢性束縛應(yīng)激所致大鼠睡眠時(shí)相改變的干預(yù)作用，以期為酸棗仁湯在臨床上更廣泛應(yīng)用奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，8月齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心(GLP實(shí)驗(yàn)室)提供，許可證號(hào):黑動(dòng)字第P00700619號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

十六道生理記錄儀(MP－150型，美國(guó)BIOPAC公司);恒溫恒濕自動(dòng)光控電子屏蔽室 (8:00～20:00自動(dòng)明暗控制，P－22型，常州第二無(wú)線電廠);腦立體定位儀(大鼠用，美國(guó)Stoelting公司);自凝牙科水泥(批號(hào)04－08－05，哈爾濱齒科器材廠);大鼠慢性應(yīng)激束縛器(自制，有機(jī)玻璃材料，口徑4cm，管壁有直徑為0.5cm的通風(fēng)口，確保大鼠呼吸通暢)。

1.3 主要試劑

戊巴比妥鈉(批號(hào)WS20060401，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用時(shí)以生理鹽水配制成0.5%溶液);注射用青霉素鈉(批號(hào)A05065612，哈藥集團(tuán)制藥總廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物

酸棗仁、茯苓、川芎、知母、甘草均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室孫慧峰副教授鑒定，符合《中國(guó)藥典》的規(guī)定。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酸棗仁湯的制備

結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，按照酸棗仁湯中五味藥的比例(酸棗仁∶茯苓∶川芎∶知母∶甘草 =18∶5∶10∶10∶5)，稱取5 味藥材共 456g，加 8 倍量的水，浸泡1h后，沸水煎煮30min，濾過，藥渣再加6倍量水，沸后煎煮20min，濾過，合并兩次濾液，濃縮至700ml，使每毫升濃縮液中含生藥量的濃度為 0.65g/ml，備用。

2.2 大鼠皮層腦電與肌電電極的埋置

首先將Wistar大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)1周后再進(jìn)行腦電和肌電電極的埋置。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg，待大鼠麻醉后，在腦立體定位儀上將其固定，剪掉頭部毛，酒精消毒后，剪開頭頂皮膚，撥開筋膜，用酸蝕劑腐蝕并充分暴露顱骨，用干脫脂棉擦凈，直至顱骨表面干潔。在顱骨上用大鼠腦立體定位儀定位(坐標(biāo):AP －2，R2;AP+2，R2)，用牙科電鉆鉆孔，將2個(gè)直徑為1mm不銹鋼螺絲釘植入顱骨內(nèi)，并使之與硬腦膜接觸，但不穿透硬腦膜，作為腦電皮層電極;用兩根酒精消毒后的導(dǎo)線穿過頭后方的頸肌，作為肌電電極。將電極螺絲釘用焊錫制成微型插頭，連接微型插座，在顱骨中間(坐標(biāo):AP+5，R0)鉆孔，植入螺絲用以固定微型電極插座，然后以牙科水泥固定，縫合毛皮層［5－6］。大鼠電極埋置后將每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于有機(jī)玻璃籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，腹腔注射4萬(wàn)U青霉素鈉，連續(xù)3天以避免手術(shù)造成感染，恢復(fù)7天后，按照下述方法進(jìn)行造模。

2.3 慢性束縛應(yīng)激大鼠模型的復(fù)制

將大鼠置于有機(jī)玻璃制成的束縛管中，管壁有直徑為0.5cm的通風(fēng)口，確保通風(fēng)良好，大鼠能夠自由呼吸，大鼠在束縛管中雖然活動(dòng)收到限制，但不會(huì)造成肉眼可見的軀體上的傷害，大鼠每日束縛應(yīng)激時(shí)間為6小時(shí)(9:00～15:00)，連續(xù)14天，應(yīng)激時(shí)禁水禁食，應(yīng)激結(jié)束后，將大鼠放回籠中自由進(jìn)食和飲水［7－8］。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

將24只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為3組，即空白組、模型組和給藥組，每組8只。模型組和給藥組大鼠按照2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行造模，空白組大鼠不做任何應(yīng)激刺激，只是在另2組大鼠造模期間禁水禁食(9:00～15:00)。給藥組大鼠自造模第1天開始灌胃酸棗仁湯16ml/kg，連續(xù)14天，空白組和模型組大鼠每日灌胃相同體積的生理鹽水。

模型復(fù)制后，采用十六道生理記錄儀描記每只大鼠12h(8:00～20:00)的腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制為避光、通風(fēng)、隔音、電磁屏蔽狀態(tài)，采用自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)行每天12h(8:00～20:00)的明暗光照周期處理，屏蔽室內(nèi)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度40% ～60%。

2.5 大鼠睡眠時(shí)相劃分和定量分析指標(biāo)

根據(jù)不同睡眠時(shí)相波形的特點(diǎn)［9］，將大鼠睡眠－覺醒周期分為覺醒(Wake)、淺睡期(LS)、慢波睡眠(SWS)和快動(dòng)眼睡眠(REMS)等4個(gè)時(shí)相［10］。通過對(duì)大鼠EEG和EMG的分析，統(tǒng)計(jì)出每一類睡眠時(shí)相的持續(xù)時(shí)間和所占睡眠總時(shí)間的比例。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行方差分析，設(shè)定P＜0.05為差異具有顯著意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠各睡眠時(shí)相持續(xù)時(shí)間的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

由表1和圖1可以看出，與空白組相比，模型組大鼠在睡眠總時(shí)間、LS、SWS以及REM睡眠的持續(xù)時(shí)間均顯著縮短(P＜0.05)，由圖1可以直觀看出，SWS期睡眠持續(xù)時(shí)間縮短的幅度較大。與模型組相比，酸棗仁湯給藥組大鼠在睡眠總時(shí)間、LS和SWS期睡眠持續(xù)時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，REM期睡眠雖有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相持續(xù)時(shí)間的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

表1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相持續(xù)時(shí)間的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用(s)

表1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相持續(xù)時(shí)間的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用(s)

注:與空白組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05。

組別 n 睡眠總時(shí)間(min)LS(min)SWS(min)REM(min)空白組 8 356.7 ±86.1 180.9 ±54.5 142.8 ±50.3 35.2 ±12.2模型組 8 176.4 ±66.8*103.0 ±42.5*41.9 ±10.6*19.4 ±5.7*給藥組 8 260.3 ±77.6#145.0 ±70.1#93.1 ±44.8#22.5 ±7.3

表2 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠各時(shí)相所占睡眠總時(shí)間比例的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用(s)

表2 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠各時(shí)相所占睡眠總時(shí)間比例的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用(s)

注:與空白組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05。

組別 n LS(%)SWS(%)REM(%)空白組8 50.7 ±4.6 40.8 ±10.3 9.8 ±3.5模型組 8 62.3 ±6.5* 25.2 ±8.7* 11.5 ±3.2給藥組 8 55.7 ±5.1 35.8 ±9.1#8.6 ±3.9

圖2 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠各時(shí)相所占睡眠總時(shí)間比例的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

3.2 慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠各睡眠時(shí)相所占睡眠總時(shí)間比例的影響及酸棗仁湯的干預(yù)作用

由表2和圖2可見，與空白組相比，模型組大鼠LS期所占比例顯著增加(P＜0.05)，SWS期睡眠所占的比例則明顯減小(P＜0.05)，而REM期所占睡眠總時(shí)間的比例與空白組相比基本持平。與模型組相比，酸棗仁湯給藥組大鼠SWS期所占睡眠總時(shí)間的比例顯著提高(P＜0.05)，LS期和REM期睡眠所占比例雖有下降的趨勢(shì)，但是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(P＞0.05)。

4 討論

應(yīng)激是機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)出現(xiàn)的非特異性的全身反應(yīng)。當(dāng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體需要調(diào)動(dòng)各種代償機(jī)制去應(yīng)對(duì)應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷，由此引起一系列生理、生化的改變，而長(zhǎng)期慢性應(yīng)激可引起機(jī)體代償機(jī)制失調(diào)，導(dǎo)致認(rèn)知、情緒和內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化。已有研究證實(shí)，長(zhǎng)期的慢性束縛應(yīng)激可以影響大鼠體重的自然增長(zhǎng)［11］，使大鼠自主活動(dòng)減少［12］，表現(xiàn)出抑郁傾向，而且國(guó)外已有束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道［13］。酸棗仁湯是中醫(yī)臨床上具有改善睡眠作用的經(jīng)典方劑，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也提示酸棗仁湯可以改善由慢性情緒應(yīng)激所導(dǎo)致的睡眠障礙［14－15］?；谏鲜鏊悸?，本研究通過大鼠皮層腦電和肌電電極的埋置，監(jiān)測(cè)大鼠12h的EEG和EMG，進(jìn)而探討酸棗仁湯對(duì)慢性束縛應(yīng)激所致大鼠睡眠結(jié)構(gòu)改變的干預(yù)作用。

在復(fù)制大鼠慢性束縛應(yīng)激的模型之前，先對(duì)大鼠進(jìn)行皮層腦電和肌電電極的埋置，這一步驟十分關(guān)鍵，在用牙科電鉆穿透大鼠頭骨時(shí)的力量要拿捏適度，目的是剛好穿透大鼠頭骨，又不損傷腦膜，另外要確保大鼠暴露的頭骨用酸蝕劑擦拭得表面干潔，以便牙科水泥更好的固定，防止電極脫落。

LS期表示機(jī)體處于一種淺睡狀態(tài);而SWS期睡眠則是深睡眠狀態(tài)，這一期對(duì)于緩解軀體上的疲勞有著十分重要的作用;當(dāng)機(jī)體處于REM期睡眠時(shí)，表明機(jī)體正處于“做夢(mèng)期”，它對(duì)于緩解機(jī)體腦疲勞有十分重要的意義，這一期睡眠可以促進(jìn)記憶的鞏固和兒童智力的發(fā)育。正常的睡眠結(jié)構(gòu)應(yīng)該是各睡眠時(shí)相保持一定的持續(xù)時(shí)間并且占有相應(yīng)的比例，如果睡眠的持續(xù)時(shí)間減少或者各個(gè)睡眠時(shí)相比例嚴(yán)重失調(diào)，就會(huì)影響睡眠的質(zhì)量。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，慢性束縛應(yīng)激可以明顯縮短大鼠睡眠總時(shí)間、LS、SWS以及REM睡眠的持續(xù)時(shí)間，并改變了大鼠各睡眠時(shí)相所占睡眠總時(shí)間的正常比例，此時(shí)大鼠各睡眠時(shí)相間的平衡已被打亂，這和國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果較為相似［13］;而酸棗仁湯可以明顯對(duì)抗慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠結(jié)構(gòu)造成的影響，表現(xiàn)為延長(zhǎng)各睡眠時(shí)相的持續(xù)時(shí)間，部分恢復(fù)其所占睡眠總時(shí)間的比例。

本研究初步闡明了慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠結(jié)構(gòu)的影響，并從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度明確了酸棗仁湯的藥效學(xué)基礎(chǔ)，這為本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)，從神經(jīng)遞質(zhì)的層面來(lái)探討酸棗仁湯對(duì)抗慢性束縛應(yīng)激所致睡眠障礙的機(jī)制奠定了前期研究基礎(chǔ)。

［1］劉建國(guó)，王玉堂.應(yīng)激與室性心律失常［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2008，14(2):155 －156.

［2］徐瑞鑫，陳春苗，李廷利.沖突性心理應(yīng)激對(duì)大鼠睡眠時(shí)相及睡眠節(jié)律的影響［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2012，21(2):105－107.

［3］Koehl M，Bouyer JJ，Darnaudéry M，et al.The effect of restraint stress on paradoxical sleep is influenced by the circadian cycle［J］.Brain Research，2002，937(1 －2):45 －50.

［4］喬昱婷，譚慶榮，王百忍，等.慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠行為及前額葉皮質(zhì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化的影響［J］.中華精神科雜志，2007，40(3):172 －175.

［5］Depoortere H.Some aspects of the polygraphic studies on sleep －wake － fulness cycle in rat［J］.Waking sleeping，1980，4(1):47 －62.

［6］霍榮，王寶珍，李廷利.百麥安神沖劑對(duì)失眠大鼠睡眠時(shí)相的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，25(5):16 －18.

［7］Iraci Lucena da Silva Torres，Simone N.S Cucco，Marcio Bassani，et al.Long－lasting delayed hyperalgesia after chronic restraint stress in rats－ effect of morphine administration［J］.Neuroscience Research，2003，35(3):277 －283.

［8］孟珊珊，劉洪文.慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠體質(zhì)量、血清皮質(zhì)酮和前額葉皮質(zhì)cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的影響［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2011，18(5):263 －265.

［9］庫(kù)寶善.慢波睡眠的藥理學(xué)研究［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，31(3):204－208.

［10］張杰，王明時(shí).睡眠腦電的研究［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)，1997，20(2):65 －68.

［11］陳純姿，于慧.兩種不同慢性應(yīng)激對(duì)大鼠體質(zhì)量與自發(fā)活動(dòng)的影響［J］.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，22(4):218 －220.

［12］王天芳，陳易新，季紹良，等.慢性束縛致慢性疲勞動(dòng)物模型的研制及其行為學(xué)觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5(5):25－29.

［13］M Koehl，JJ Bouyer，M Darnaudéry，et al.The effect of restraint stress on paradoxical sleep is influenced by the circadian cycle［J］.Brain Research，2002，937:45 －50.

［14］于鑫.慢性情緒應(yīng)激所致大鼠睡眠剝奪模型復(fù)制及酸棗仁的干預(yù)作用研究［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［15］田旭升，胡妮娜，宋琳，等.酸棗仁湯對(duì)抑郁癥模型大鼠海馬TNF－α、IL－1β及c－fos表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(2):44 －46.