寒凝氣滯血瘀證大鼠動(dòng)物模型的建立及評價(jià)

賈丹兵，于淼，李乃民，朱宇，唐立明，李春杰，劉珊，韓玉生，鞏沅鑫，魏博

(1.中國人民解放軍第211醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150080;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

血瘀證是指血液循環(huán)遲緩，或流行不暢，甚則血液瘀結(jié)停滯成積的病理狀態(tài)［1］。《內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為寒邪和情志失調(diào)是引起血瘀證發(fā)生的主要致病因素，氣血調(diào)和，脈道通利是血液正常運(yùn)行的基本條件。如《靈樞·癰疽》云:“寒邪客于經(jīng)絡(luò)之中則血泣，血泣則脈不通。”《靈樞·癰疽》云:“怒則氣上逆，胸中蓄積，血?dú)饽媪餮}不行?！?/p>

寒凝氣滯血瘀證動(dòng)物模型的制作是開展寒凝氣滯血瘀證實(shí)驗(yàn)研究的重要平臺，近年來許多學(xué)者研究了有關(guān)寒凝血瘀證動(dòng)物模型的制作，為本領(lǐng)域的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)從“寒邪”和“氣滯”兩方面同時(shí)入手，通過對三種不同方法制作的大鼠血瘀證模型的比較，探索一種更能接近機(jī)體寒凝氣滯血瘀證病理過程的動(dòng)物模型現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

選用清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組:A:正常組;B:對照Ⅰ組(分為B1、B2兩組);C:對照Ⅱ組;D:模型組(分為 D1、D2兩組)。每組各10只，分別編號、標(biāo)記、稱重。

1.2 造模方法

A組正常飼養(yǎng)。B組大鼠置于低溫冰柜，在－20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4h，每日1次，連續(xù)7日，B1組于第8日觀察客觀指標(biāo)并取材檢測;B2組于第8日開始常規(guī)飼養(yǎng)，第14日觀察客觀指標(biāo)并取材檢測。C組大鼠皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08ml/100g，注射2次，間隔4h，第1次注射給藥后2h將大鼠置4℃冰水浸泡5min，于第2日觀察客觀指標(biāo)并取材檢測。D組大鼠在第1日皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08ml/100g，注射2次，間隔4h，第1次注射給藥后2h將大鼠置4℃冰水浸泡5min，于第2日將大鼠分別放入低溫冷柜鼠籠中，在－20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4h，每日1次，連續(xù)7日，D1組于第9日觀察客觀指標(biāo)并取材檢測;D2組于第9日開始常規(guī)飼養(yǎng)，第15日觀察客觀指標(biāo)并取材檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1)癥狀表現(xiàn):觀察造模前后大鼠的癥狀改變。2)客觀指標(biāo):各組大鼠分別腹腔注射10%的水合氯醛300mg/100g，統(tǒng)一麻醉成功后，分別測量基礎(chǔ)體溫(耳溫、肛溫)。3)血液流變學(xué):腹主動(dòng)脈取血4ml于肝素抗凝真空采血管中，測定全血高切黏度、中切黏度、低切黏度、血漿黏度。另取全血置于壓積管中，3000轉(zhuǎn)離心30min，測紅細(xì)胞壓積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0軟件統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間數(shù)據(jù)顯著性差異采用t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 癥狀表現(xiàn)

與正常組相比較，各組均出現(xiàn)寒戰(zhàn)、打噴嚏、流涕、弓背毛松、口唇鼻耳色紫和飲水增多等表現(xiàn)。B、D組隨造模時(shí)間延長又表現(xiàn)出明顯的唇周發(fā)黑，耳色暗紅、爪尾部紫暗、畏寒喜暖、踡縮少動(dòng)、大便稀、食少、體重減輕等癥狀，其中模型B1、D1組表現(xiàn)最為明顯;各組耳廓欠潤澤，微血管清晰呈暗紅色，其中模型B、D組耳廓明顯腫大暗紅，微血管紫暗，密度增加，色澤明顯加深，肉眼差異顯著，而模型C組肉眼差異不明顯。

2.2 客觀指標(biāo)

造模前后各組大鼠體溫(耳溫、肛溫)變化:造模前各組間大鼠耳溫、肛溫相比較，無明顯差異(P＞0.05);造模后B、C、D組大鼠耳溫、肛溫與造模前相比較，除B2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P ＜0.01)，B1、C、D1組體溫明顯降低。造模后各組間大鼠耳溫、肛溫相比較，以D1組最低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(結(jié)果見表1)。

各組間相比較，造模前后體溫降低趨勢為:D1組≥B1組≥C組＞D2組＞B2組。

表1 各組大鼠造模前后體溫變化(s，n=10)

表1 各組大鼠造模前后體溫變化(s，n=10)

注:與同組造模前相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 耳溫(℃)肛溫(℃)造模前 造模后 造模前 造模后正常 A 組 30.41 ±0.59 30.62 ±0.83 36.44 ±0.51 36.35 ±0.64對照 B1 組 30.55 ±0.88 28.17 ±0.49＊＊36.55 ±0.54 35.01 ±0.68＊＊對照 B2 組 30.21 ±0.52 29.54 ±0.41＊＊36.35 ±0.56 35.85 ±0.53對照 C 組 30.24 ±0.54 28.21 ±0.51＊＊36.50 ±0.58 34.92 ±0.65＊＊模型D1 組 30.37 ±0.69 28.08 ±0.54＊＊36.62 ±0.71 34.61 ±0.42＊＊模型 D2 組 30.24 ±0.53 28.90 ±0.62＊＊36.64 ±0.45 35.67 ±0.58*

2.3 血液流變學(xué)

2.3.1 造模后各組大鼠全血黏度、血漿黏度變化

與正常組比較，各組大鼠全血黏度低切、中切、高切均顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，以D1組升高最為明顯;血漿黏度升高，除C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P ＞0.05)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)。B2組與B1組相比，全血黏度低切、中切、高切均有降低趨勢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D2組與D1組相比，全血低切和中切黏度有降低趨勢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(結(jié)果見表2)。

各組間相比較，全血黏度、血漿黏度升高趨勢為:D1組＞B1組＞D2組＞B2組≥C組。

表2 各組大鼠造模后全血黏度和血漿黏度變化(s，n=10)

表2 各組大鼠造模后全血黏度和血漿黏度變化(s，n=10)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

正常A組21.67 ±1.37 4.84 ±0.26 3.60 ±0.12 1.17 ±0.26對照 B1 組 31.27 ±1.92＊＊7.02 ±0.48＊＊ 4.50 ±0.16＊＊ 1.22 ±0.58*對照 B2 組 28.27 ±1.69＊＊6.49 ±0.44＊＊ 4.20 ±0.24＊＊ 1.21 ±0.42對照 C 組 26.82 ±1.16＊＊6.31 ±0.22＊＊ 3.88 ±0.19* 1.20 ±0.32模型 D1 組 33.65 ±2.03＊＊7.15 ±0.37＊＊ 4.62 ±0.21＊＊ 1.26 ±0.24＊＊模型 D2 組 30.48 ±1.97＊＊6.67 ±0.34＊＊ 4.47 ±0.14＊＊ 1.22 ±0.36*

2.3.2 造模后各組大鼠紅細(xì)胞壓積和聚集指數(shù)變化

與正常組比較，各組大鼠紅細(xì)胞壓積均顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。B2組與B1組相比，D2組與D1組相比，紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)有降低趨勢，以D1組升高最為明顯(結(jié)果見表3)。

各組間相比較，紅細(xì)胞壓積升高趨勢為:D1組＞D2組＞B1組＞B2組＞C組;紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高趨勢為:D1組＞B1組≥C組＞D2組＞B2組。

表3 各組大鼠造模后紅細(xì)胞壓積和聚集指數(shù)變化(s，n=10)

表3 各組大鼠造模后紅細(xì)胞壓積和聚集指數(shù)變化(s，n=10)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 紅細(xì)胞壓積(%)紅細(xì)胞聚集指數(shù)正常A組37.18 ±1.33 6.02 ±0.45對照 B1組 43.08±3.30＊＊ 6.96±0.64*對照 B2組 42.21±2.02＊＊ 6.74±0.55*對照 C 組 41.01 ±2.07* 6.93 ±0.60*模型 D1組 46.22±1.49＊＊ 7.29±0.70＊＊模型 D2組 44.48±1.83＊＊ 6.81±0.50*

3 討論

中醫(yī)動(dòng)物模型是根據(jù)中醫(yī)理論，對人類疾病原型的某些特征進(jìn)行模擬復(fù)制，創(chuàng)造出的具有人工疾病和證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［2］。近年來，根據(jù)中醫(yī)血瘀證的病因、病機(jī)建立的寒凝血瘀證動(dòng)物模型的方法較多，如吳墾莉等［3］采用對家兔后肢低溫冷凍，局部凍傷引起紫紺、水腫造成寒凝血瘀證動(dòng)物模型;鄭小偉等［4］采用全身冷凍法，在大鼠身上復(fù)制寒凝血瘀證量化模型;成秀梅等［5］將大鼠置于冰水中造成寒凝血瘀動(dòng)物模型;王曉嵐等［6］采用腎上腺素加冰水浴法造成大鼠寒凝血瘀證急性心肌缺血模型。這些動(dòng)物模型雖都有其特點(diǎn)，但無論是單因素還是復(fù)合因素，在停止作用后其形成的血瘀持續(xù)時(shí)間均較短暫，與臨床血瘀證尚有一定的差距。

毛騰敏等［7］證實(shí)未失去平衡的正常機(jī)體難以形成“血瘀”，形成后亦能較快恢復(fù);但內(nèi)傷、外感雙重激烈刺激對于未失去平衡的機(jī)體亦可形成“血瘀”。中醫(yī)理論認(rèn)為:寒為陰邪，主收引，性凝滯，寒邪作用于血脈，血脈收引攣縮，血脈拘攣則其管徑變細(xì)變窄，血流量減少，另一方面使血液凝滯，血行緩慢而化生瘀血;“氣為血之帥，血為氣之母”，故氣滯可導(dǎo)致血瘀，而血瘀也可引起氣滯。七情中的憂怒為血瘀常見病因之一，憂怒兩種情志太過，為血瘀證發(fā)生的主要原因。依據(jù)上述論述，我們以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理生理學(xué)基礎(chǔ)，從“寒凝”與“氣滯”兩方面入手，建立動(dòng)物模型。給大鼠皮下注射大劑量腎上腺素注射液模擬“暴怒”時(shí)機(jī)體分泌大量腎上腺素的特點(diǎn)，以冰水浸泡及持續(xù)低溫冷冰模擬“寒邪”侵襲，二者綜合作用復(fù)制出黏、濃、凝狀態(tài)的“寒凝氣滯血瘀證”模型。同時(shí)與單純低溫冷凍所致“寒凝血瘀證”和腎上腺素加冰水浴所致“氣滯血瘀證”模型進(jìn)行了對比研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠較正常組有明顯的寒凝氣滯血瘀癥狀且體溫降低趨勢顯著;血液流變學(xué)顯示，模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高趨勢最為明顯。

綜上所述，可以認(rèn)為采用“腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法”方法造成的寒凝氣滯血瘀證動(dòng)物模型，與采用單一的突發(fā)強(qiáng)冷刺激造成的“寒凝血瘀證”和藥物加冰水浴所致的“氣滯血瘀證”相比，更符合血瘀證“久病”、“慢性”的特點(diǎn)，更能接近臨床血瘀證的發(fā)病過程［8］，符合中醫(yī)證候特點(diǎn)，也與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)相一致。且該模型具有操作方法簡單，模型穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以確定大鼠寒凝氣滯血瘀證模型成立。

［1］韓耀巍，王學(xué)嶺.寒凝血瘀證實(shí)驗(yàn)及臨床研究近況［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(3):167 －168.

［2］谷萬里，張俏，史載祥.寒凝血瘀證動(dòng)物模型的研究述評［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(6):89 －91.

［3］吳墾莉，張珊珊.寒凝血瘀證動(dòng)物模型的研制［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1996，2(2):49 －50.

［4］鄭小偉.寒凝血瘀證動(dòng)物模型的量化研究［J］.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，23(2):43 －45.

［5］成秀梅，杜惠蘭，李丹.寒凝血瘀證動(dòng)物模型的創(chuàng)建［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(8):604 －605.

［6］王曉嵐，張?zhí)N慧.心痛寧對大鼠缺血心肌細(xì)胞游離鈣濃度的影響［J］.江蘇中醫(yī)藥，2002，23(7):44 －45.

［7］毛騰敏，林建和.“血瘀”病例模型探索［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1985，17(4):246 －248.

［8］賈丹兵，于淼，李乃民，等.參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠血清中6－keto－PGF1a、TXB2及氧自由基代謝的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014，42(3):26－28.