雙溴代馬蹄金素衍生物的合成及其抗HBV活性

梁光平，胡占興，黃正明，劉青川，張建新，梁光義，徐必學(xué)

(1.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 豐臺(tái) 100039)

乙肝是由乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的，全球估計(jì)有20億人感染乙肝病毒，約有4億人患有慢性肝臟感染疾病，絕大部分人群分布在亞太地區(qū)[1]。全球每年有上百萬(wàn)人死于乙肝病毒感染的相關(guān)疾病[2-3]，以拉米夫定為代表的核苷類藥物和以干擾素-α為代表的生物類免疫調(diào)節(jié)劑等主流藥物均存在不良反應(yīng)、耐藥以及價(jià)格昂貴等缺陷。因此，尋找和開(kāi)發(fā)新的抗乙肝病毒藥物具有重要的意義[4]。

馬蹄金素[N-(N-苯甲?；?L-苯丙氨酰基)-O-乙?；?L-苯丙氨醇，MTS]是本研究組從馬蹄金(DichondrarepensForst.)中分離到的化合物，具有較好的抗HBV活性(見(jiàn)圖1)，查閱資料發(fā)現(xiàn)該化合物是新化學(xué)骨架類型的抗乙肝病毒化合物。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到一系列衍生物，體外抗HBV活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)其中有一些化合物具有較好的抗乙肝病毒活性[5-8]。而含溴的化合物在抗病毒方面具有良好的抑制活性[9-10]，本文以馬蹄金素為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)合成具有雙溴取代的馬蹄金素類似物，并對(duì)其進(jìn)行初步的體外抗HBV活性測(cè)試，以期在拓寬?cǎi)R蹄金素結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物類型的同時(shí)，獲得更多具有深入研究?jī)r(jià)值的修飾產(chǎn)物。

1 儀器與試劑

核磁共振譜以TMS為內(nèi)標(biāo)，用Inova-400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)測(cè)定。質(zhì)譜用HP-5793質(zhì)譜儀測(cè)定(美國(guó)Hewlett-Packard公司)。柱色譜用硅膠(300～400目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純或化學(xué)純產(chǎn)品，除特別說(shuō)明外，未經(jīng)處理直接使用。6,8-二溴-L-酪氨酸(化學(xué)純，BDH試劑)、L-苯丙氨醇(純度99%，揚(yáng)州寶盛生物化工有限公司)和L-苯丙氨酸甲酯(純度99%，揚(yáng)州寶盛生物化工有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 目標(biāo)化合物的合成路線 合成路線如圖2所示，以6,8-二溴-L-酪氨酸為起始原料，在SOCl2以及CH3OH的作用下得化合物1；化合物1與苯甲酸在氯甲酸異丁酯(IBCF)和N-甲基嗎啉(NMM)的作用下反應(yīng)得到化合物2，再經(jīng)堿水解得化合物3，在IBCF-NMM存在下，化合物3與L-苯丙氨醇縮合得化合物4，化合物3與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽反應(yīng)得化合物6，化合物4經(jīng)取代反應(yīng)得化合物5a～5e，化合物6經(jīng)取代反應(yīng)后得化合物7a～7d。

圖1 馬蹄金素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線

試劑及反應(yīng)條件: (a) MeOH, SOCl2, rt, 2.5 h, then reflux for 30 min; (b) benzoic acid, IBCF, NMM, CH2Cl2, DMF, -5oC to rt, 8 h; (c) NaOH, DMF, rt, 1 h; (d) L-phenylalanol, IBCF, NMM, CH2Cl2, DMF, -5oC to rt, 8 h; (e) 1-Iodooctane or 1-bromohexane or 1-iodo-2-methylpropane or iodoethane, 1,4-dioxane, K2CO3, rt; (f) L-phenylalanine methyl ester hydrochloride, CH2Cl2, DMF, IBCF, NMM, -5oC to rt, 8 h; (g) 2-Dimethylaminoethyl chloride hydrochloride or 1-bromopentane or 1-iodooctane or 1-bromohexane or ethyl chloroacetate, DMF, K2CO3, rt。

2.2 化學(xué)合成 6,8-二溴-L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽①N-苯甲?；?6,8-二溴-L-酪氨酸甲酯②和N-苯甲?；?6,8-二溴-L-酪氨酸③的合成根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]的方法即可合成，3步反應(yīng)總收率為60%左右。

N-(N-苯甲?；?6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(4)的合成：取化合物3(6.65 g，15.0 mmol)，L-苯丙氨醇(2.72 g，18.0 mmol)于反應(yīng)瓶中，65℃真空干燥1 h后，在氬氣保護(hù)下，加入經(jīng)分子篩干燥的DMF(50 mL)和CH2Cl2(100 mL)溶解完全，加入NMM(3.9 mL，34.5 mmol)，冰鹽浴冷卻下，緩慢滴加含IBCF(2.4 mL，18.0 mmol)的CH2Cl2溶液20 mL。滴畢，繼續(xù)攪拌，TLC跟蹤反應(yīng)，約8 h反應(yīng)完全，加少量水終止反應(yīng)，減壓回收CH2Cl2，用乙酸乙酯(500 mL×2)萃取，有機(jī)層依次以水、稀鹽酸、飽和NaHCO3溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥，減壓回收乙酸乙酯至有大量固體析出，冷卻過(guò)濾，濾餅干燥即得化合物4(7.2 g，產(chǎn)率83%)。m.p. 234～236℃;ESI-MSm/z: 577.1 [M+H]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 9.22 (s, 1H, 7-OH), 8.54 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 1′′-CONH), 8.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-CONH), 7.75 (d,J= 7.0 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.51 (m, 3H, H-4′′-6′′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.17 (m, 5H, H-5, 9, 5′, 7′, 9′), 4.84 (t,J= 5.2 Hz, 1H, 1′-OH), 4.65 (m, 1H, H-2), 4.49 (m, 1H, H-2′), 3.20 (m, 2H, H-3), 2.95 (m, 2H, H-3′);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.4, 166.5, 149.1, 137.0, 134.0, 133.0, 132.9, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 111.6, 62.2, 54.5, 53.8, 36.7, 35.5. Anal. calcd for C25H24Br2N2O4:C 52.10, H 4.20, N 4.86; found C 52.09, H 4.21, N 4.84。

N-(N-苯甲酰基-O-二甲氨基乙基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨醇(5a)的合成：取化合物4(200 mg，0.35 mmol)、無(wú)水K2CO3(290 mg，2.1 mmol)和二甲氨基氯乙烷鹽酸鹽(60 mg，21.08 mmol)置于反應(yīng)瓶中，加入1,4-二氧六環(huán)70 mL，再加入碳酸鉀質(zhì)量10%的水，100～105℃油浴中回流3.5 h使之反應(yīng)完畢(TLC檢測(cè))。反應(yīng)液冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(200 mL)和水(100 mL)萃取，乙酸乙酯層用0.1 mol/L鹽酸反萃取，取酸水層，以0.2 mol/L的NaOH水溶液調(diào)pH 8～9，加入乙酸乙酯(200 mL)萃取，有機(jī)層經(jīng)水洗一次，無(wú)水MgSO4干燥，回收溶劑至干，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(氯仿︰甲醇，25︰1)得化合物5a(162 mg，收率為72%)。m.p. 218～221°C; ESI-MSm/z: 648.2 [M+H]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.51 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.94 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.55-7.44 (m, 3H, H-6′-8′), 7.24-7.12 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.83 (m, 1H, H-2), 4.70-4.63 (m, 1H, H-2′), 3.95 (t,J= 6.0 Hz, 1H, -OH), 3.90 (m, 2H, 7-OCH2CH2N), 3.37-3.31 (m, 4H, H-3, 1′), 3.01 (m, 1H, H-3′a), 2.94-2.85 (m, 2H, 7-OCH2CH2N), 2.70-2.65 (m, 1H, H-3′b), 2.21 (s, 6H, -N(CH3)2);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.9, 137.8, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 71.2, 62.1, 58.1, 54.5, 52.5, 45.4, 36.4, 35.9. Anal. calcd for C29H33Br2N3O4: C 53.80, H 5.14, N 6.49; found C 53.47, H 5.28, N 6.52。

N-(N-苯甲?；?O-正戊基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨醇(5b)的合成：取化合物4 (150 mg, 0.26 mmol)和無(wú)水K2CO3(290 mg, 0.21 mmol)置于反應(yīng)瓶中, 依次加入DMF(10 mL)，溴代正戊烷(1.30 mmol)，所得混合物于50 ℃油浴中攪拌4.5 h至反應(yīng)完畢(TLC檢測(cè))。待反應(yīng)液冷卻至室溫后, 加入乙酸乙酯(200 mL)和水(100 mL)萃取，有機(jī)層經(jīng)水洗，無(wú)水MgSO4干燥，濃縮，殘留物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯，4∶1)得85 mg白色固體5b，產(chǎn)率為50%。m.p. 207～210 °C; ESI-MSm/z: 669.4 [M+Na]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.50 (d,J=8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.97 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.84 (m, 1H, H-2), 4.66 (m, 1H, H-2′), 3.89 (m, 3H, 1′-OH, 7-OCH2(CH2)3CH3), 3.32 (m, 2H, H-1′), 3.04-2.87 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.76 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)2CH3), 1.46(m, 2H, 7-O(CH2)2CH2CH2CH3), 1.28 (m, 2H, 7-O(CH2)3CH2CH3), 0.91 (t,J= 7.0 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.2, 150.9, 139.0, 137.8, 134.0, 133.4, 131.3, 129.0, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 67.3, 62.1, 54.5, 52.5, 36.4, 35.9, 29.4, 25.7, 22.0, 14.0. Anal. calcd for C30H34Br2N2O4: C 55.74, H 5.30, N 4.33; found C 55.75, H 5.27, N 4.34。

N-(N-苯甲?；?O-正辛基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5c)的合成：取化合物4(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(192 mg,1.4 mmol)、碘代正辛烷(210 mg, 0.9 mmol)，參照化合物5b的制備方法得到72 mg白色粉末，收率為60%。m.p. 233～235 °C; ESI-MSm/z: 689.4 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.53 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.97 (d,J= 8.0 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.53 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.18 (m, 4H, H-4′′, 6′′, 5′, 9′), 7.14 (m, 1H, H-5′′), 4.84 (t,J= 5.2 Hz, 1H, 1′-OH), 4.65 (m, 1H, H-2), 3.91 (m, 1H, H-2′), 3.87 (d,J= 6.4 Hz, 2H, 7-OCH2(CH3)6CH3), 3.35-3.28 (m, 2H, H-1′), 3.03-2.85 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.67 (m, 1H, H-3′b), 1.72 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)5CH3), 1.44 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)4CH3), 1.26 (m, 8H, 7-O(CH2)3(CH2)4CH3), 0.85 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-O(CH2)7CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.8, 137.7, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.1, 128.0, 127.3, 125.8, 117.0, 73.0, 62.1, 54.4, 52.5, 36.4, 35.9, 31.2, 29.4, 28.7, 28.5, 25.3, 22.0, 13.9. Anal. calcd for C33H40Br2N2O4: C 57.57, H 5.86, N 4.07; found C 57.55, H 5.85, N 4.10。

N-(N-苯甲?；?O-正己基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨醇(5d)的合成：取化合物4(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(192 mg, 1.4 mmol)、溴代正己烷(143 mg, 0.9 mmol)，參照化合物5b的制備方法得到75 mg白色粉末，收率為65%。m.p. 229～232 °C; ESI-MSm/z: 661.4 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.52 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.96 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.84 (m, 1H, H-2), 4.66 (m, 1H, H-2′), 3.91-3.85 (m, 3H, 1′-OH, 7-OCH2(CH2)4CH3), 3.37-3.28 (m, 2H, H-1′), 3.02-2.85 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.74 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)3CH3), 1.44 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 1.29 (m, 4H, 7-O(CH2)3(CH2)2CH3), 0.87 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.9, 137.8, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 73.0, 62.1, 54.5, 52.5, 36.4, 35.9, 31.0, 29.4, 24.9, 22.0, 13.9. Anal. calcd for C31H36Br2N2O4: C 56.38, H 5.49, N 4.24; found C 56.09, H 5.84, N 4.64。

N-(N-苯甲?；?O-乙酸乙酯基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5e)的合成：取化合物4(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(192 mg, 1.4 mmol)、氯乙酸乙酯(106 mg, 0.9 mmol)，參照化合物5b的制備方法得到47 mg白色粉末，收率為41%。m.p. 155～157°C; ESI-MSm/z: 663.2 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.53 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.96 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.81 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.86 (t,J= 5.0 Hz, 1H, 1′-OH), 4.68 (m, 2H, H-2, 2′), 4.42 (s, 2H, 7-OCH2COOCH2CH3), 3.94 (m, 2H, 7-OCH2COOCH2CH3), 3.32 (m, 2H, H-1′), 3.04-2.87 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.28 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-OCH2COOCH2CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 171.4, 170.2, 166.1, 150.9, 139.0, 137.9, 134.1, 133.4, 131.3, 129.0, 128.2, 128.0, 127.3, 125.7, 118.3, 70.1, 66.9, 62.5, 54.9, 52.5, 36.9, 35.9, 14.1. Anal. calcd for C29H30Br2N2O6: C 52.59, H 4.57, N 4.23; found C 52.25, H 4.54, N 4.04。

N-(N-苯甲酰基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨酸甲酯(6)的合成：取化合物3(4.43 g，10.0 mmol)，L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(2.59 g，12.0 mmol)，NMM(2.6 mL，23.0 mmol)，IBCF(1.6 mL，12.0 mmol)，按化合物4的合成方法進(jìn)行，得化合物6(4.9 g，產(chǎn)率81.1%)。m.p. 218～219°C; ESI-MSm/z: 627.0 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.55 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 1′′-CONH), 8.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-CONH), 7.75 (d,J= 6.8 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.51 (m, 3H, H-4′′-6′′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.17 (m, 5H, H-5, 9, 5′, 7′, 9′), 4.65 (m, 1H, H-2), 4.49 (m, 1H, H-2′), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.20 (m, 2H, H-3), 2.95 (m, 2H, H-3′);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.4, 166.5, 149.1, 137.0, 134.0, 133.0, 132.9, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 111.6, 54.5, 53.8, 52.0, 36.7, 35.5. Anal. calcd for C26H24Br2N2O5: C 51.68, H 4.00, N 4.64; found C 51.65, H 4.01, N 4.63。

N-(N-苯甲酰基-O-正辛基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨酸甲酯(7a)的合成：取化合物6(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(183 mg, 1.3 mmol)、碘代正辛烷(200 mg, 1.3 mmol)，參照化合物7a的制備方法得到79 mg白色粉末，收率為67%。m.p. 177～179°C; ESI-MSm/z: 739.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.55-8.51 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.76-7.74 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.45-7.41 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.73-4.67 (m, 1H, H-2), 4.54-4.48 (m, 1H, H-2′), 3.84 (m, 2H, 7-OCH2(CH2)6CH3), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 1.74-1.67 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)6CH3), 1.45-1.37 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)4CH3), 1.26-1.22 (m, 8H, 7-O(CH2)3(CH2)4CH3), 0.87-0.81 (m, 3H, 7-OCH2(CH2)6CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.3, 166.6, 151.1, 137.7, 137.0, 134.0, 133.6, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.5, 126.7, 117.2, 73.1, 54.3, 53.8, 52.0, 36.8, 35.7, 31.3, 29.5, 28.8, 28.7, 25.4, 22.2, 14.1. Anal. calcd for C34H40Br2N2O5: C 56.99, H 5.63, N 3.91; found C 57.45, H 5.65, N 4.03。

N-(N-苯甲?；?O-正己基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(7b)的合成：取化合物6(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(183 mg, 1.3 mmol)、溴代正己烷(137 mg, 0.8 mmol)，參照化合物7b的制備方法得到62 mg白色粉末，收率為54%。m.p. 149～151°C; ESI-MSm/z: 711.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ:8.55 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.75 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.43 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.74-4.68 (m, 1H, H-2), 4.54-4.49 (m, 1H, H-2′), 3.84 (t,J= 6.4 Hz, 2H, 7-OCH2(CH2)4CH3), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 1.74-1.67 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)3CH3), 1.45-1.38 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 1.30-1.25 (m, 4H, 7-O(CH2)3(CH2)2CH3), 0.85 (t,J= 7.2 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.8, 171.3, 166.6, 151.1, 137.7, 136.9, 134.0, 133.6, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 117.2, 73.2, 54.3, 53.8, 52.0, 36.8, 35.7, 31.1, 29.5, 25.1, 22.1, 14.0. Anal. calcd for C32H36Br2N2O5: C 55.21, H 5.08, N 4.15; found C 55.89, H 5.650, N 4.23。

N-(N-苯甲酰基-O-異丁基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨酸甲酯(7c)的合成：取化合物6(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(183 mg, 1.3 mmol)、碘代異丁烷(152 mg, 0.83 mmol)，參照化合物7c的制備方法得到44 mg白色粉末，收率為40%。m.p. 211-213°C; ESI-MSm/z: 683.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.57-8.53 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.77-7.74 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.45-7.41 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.73-4.68 (m, 1H, H-2), 5.54-4.48 (m, 1H, H-2′), 3.65 (d,J= 8.4 Hz, 2H, 7-OCH2CH(CH3)2), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 2.08-2.00 (m, 1H, 7-OCH2CH(CH3)2), 0.98 (d,J= 6.8 Hz, 6H, 7-OCH2CH(CH3)2);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.8, 171.2, 166.6, 150.9, 137.6, 136.9, 134.0, 133.6, 131.5, 129.1, 128.3, 127.4, 126.7, 117.1, 78.9, 54.2, 53.8, 52.0, 36.7, 35.6, 28.7, 19.1. Anal. calcd for C30H32Br2N2O5: C 54.56, H 4.88, N 4.24; found C 54.37, H 5.19, N 4.47。

N-(N-苯甲?；?O-乙基-6,8-二溴-L-酪氨?；?-L-苯丙氨酸甲酯(7d)的合成：取化合物6(100 mg)、無(wú)水碳酸鉀(183 mg, 1.3 mmol)、碘代正辛烷(129 mg, 0.83 mmol)，參照化合物7d的制備方法得到29 mg白色粉末，收率為28%。m.p. 185～188°C; ESI-MSm/z: 655.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.54 (m, 2H, 1′′-CONH, 1-CONH), 7.76 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.50 (t,J= 7.6 Hz, 1H, H-7′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.19 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.71 (m, 1H, H-2), 4.52 (m, 1H, H-2′), 3.93 (m, 2H, 7-OCH2CH3), 3.34 (s, 3H, 1′-COOCH3), 3.04-2.99 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.89 (dd,J1= 2.0,J2= 11.2 Hz, 1H, H-3′b), 1.33 (t,J= 7.0 Hz, 3H, 7-OCH2CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.7, 171.1, 166.4, 151.0, 137.6, 136.9, 133.9, 133.5, 131.4, 129.1, 128.3, 128.2, 127.3, 126.6, 117.1, 69.1, 54.1, 53.7, 51.9, 36.7, 35.6, 15.3. Anal. calcd for C28H28Br2N2O5:C 53.18, H 4.46, N 4.43; found C 52.98, H 4.51, N,4.47。

2.3 體外抗HBV活性篩選 HepG22.2.15細(xì)胞每毫升20萬(wàn)個(gè)接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔500 μL，貼壁1 d后給藥，每孔0.7 mL藥液，樣品共設(shè)20 μg·mL-1、8 μg·mL-1、3.2 μg·mL-1等3個(gè)濃度，每濃度3孔，以加等量DMSO的培養(yǎng)液代替藥液的細(xì)胞為對(duì)照組，以8 μg·mL-1的拉米夫定為陽(yáng)性對(duì)照。每3d換原濃度藥液培養(yǎng)，6d后提取HBV DNA，經(jīng)熒光定量PCR測(cè)定其DNA含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算樣品對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞DNA復(fù)制的抑制率[11]，結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1目標(biāo)化合物對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞DNA復(fù)制的抑制率

編號(hào)抑制率(%)20(μg·mL-1)8(μg·mL-1)3.2(μg·mL-1)5a89.8131.7823.345b-41.27-38.1330.995c23.4644.8033.295d14.8848.8332.035e-37.12-8.8820.227a6.2334.5012.877b42.3237.3440.357c-7.4938.363.507d-11.83-10.6910.12 拉米夫定97.74

3 結(jié)果

通過(guò)化學(xué)方法合成了11個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的馬蹄金素雙溴取代的衍生物，并對(duì)9個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行體外抗HBV活性篩選，結(jié)果顯示，化合物5a、5c、5d、7b具有較好的抑制活性，其抑制率分別為89.81% (20 μg·mL-1)、44.80% (8 μg·mL-1)、48.83% (8 μg·mL-1)、42.32% (20 μg·mL-1)。

4 討論

本研究合成了11個(gè)馬蹄金素類似物，在制備化合物5a時(shí)，以1,4-二氧六環(huán)作為溶劑，外加無(wú)水碳酸鉀質(zhì)量10 %的水，所得產(chǎn)物的收率以及反應(yīng)速率均比DMF作為溶劑的效果好，但以1,4-二氧六環(huán)作溶劑時(shí)，若沒(méi)有加適量的水，則反應(yīng)不發(fā)生。此外，還測(cè)定了9個(gè)衍生物的體外抗HBV活性，結(jié)果表明，所有化合物在低濃度時(shí)均有不同程度的抑制活性，當(dāng)濃度增加以后，部分化合物顯示出促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的活性?；衔?a在20 μg·mL-1的濃度下具有較高的抑制率，達(dá)到89.81%，接近于拉米夫定的抑制率，該化合物具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Van Damme P, Zanetti A R, Shouval D, et al.Strategies for global prevention of hepatitis B virus infection[J].Adv Exp Med Biol,2010,659:175-188.

[2] Benhenda S, Cougot D, Buendia M A, et al.Hepatitis B virus X protein molecular functions and its role in virus life cycle and pathogenesis[J].Adv Cancer Res，2009,103:75-109.

[3] Azam F, Koulaouzidis A.Hepatitis B virus and hepatocarcinogenesis[J].Ann Hepatol，2008,7(2):125-129.

[4] Zoulim F.Hepatitis B virus resistance to antiviral drugs:where arewe going?[J].Liver Int，2011,31(1):111-116.

[5] Xu B,Huang Z, Liu C，et al.Synthesis and anti-hepatitis B virus activities of Matijing-Su derivatives[J].Bioorg Med Chem,2009,17(8):3118-3125.

[6] Qiu J, Xu B, Huang Z, et al.Synthesis and biological evaluation of Matijing-Su derivatives as potent anti-HBV agents[J].Bioorg Med Chem,2011,19(18):5352-5360.

[7] 梁光平, 曹佩雪, 楊秀蝦, 等. NO型馬蹄金素衍生物的合成及其初步的抗HBV活性[J].有機(jī)化學(xué),2014,DOI:10.6023/cjoc201312003.

[8] 邱凈英, 黃正明, 潘衛(wèi)東, 等.馬蹄金素衍生物的合成及抗乙肝病毒活性[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2012, 43(5):390-394.

[9]柴慧芳, 趙燕芳, 宮平.5-羥基-6-溴-1H-吲哚-3-羧酸酯類衍生物的合成及其抗乙肝病毒活性[J].貴州化工, 2008,33(4):20-23.

[10] 戴志群, 張煒煒, 王文清.1,5-二乙?；?2,4-二氧六氫-1,3,5-三嗪糖苷的合成及抗病毒活性[J].化學(xué)世界,2009,(12):737-739.

[11] Korba B E，Gerin J L.Antisense oligonucleotides are effective inhibitors of hepatitis B virus replication in vitro[J].Antiviral Res,1995,28(3):225-242.