丹紅注射液對(duì)腦梗死患者外周血中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響

李文玉， 董斌春， 王 路， 王曉紅， 楊 鑫， 宋春伶

急性腦梗死后成人腦組織再生能力有限，血管新生及側(cè)枝循環(huán)建立是治療關(guān)鍵，對(duì)腦梗死后神經(jīng)元存活及預(yù)后有重要意義，但其內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等過(guò)程尚未闡明。正常機(jī)體內(nèi)存在多種促血管新生的因子，與抑制血管新生因子相互作用，兩者保持平衡。促進(jìn)血管新生因子主要包括:VEGF、bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)。抑制血管新生因子目前發(fā)現(xiàn)的有:血管生成抑素(angiostatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、凝血酶敏感蛋白(TSPs)、干擾素α、干擾素β、色素上皮源性生長(zhǎng)因子(PEDF)、白細(xì)胞介素10、12(IL-10、IL-12)等。

目前研究較多的是VEGF及bFGF在血管新生中的作用，VEGF是一種重要的促血管新生因子，腦組織正常情況下無(wú)VEGF表達(dá)，腦缺血、缺氧后，VEGF/VEGF受體(VEGFR)系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)，并與其受體結(jié)合，刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起直接保護(hù)作用，并延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間［1～3］，促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管形成［4，5］，改善缺血半暗帶區(qū)血流供應(yīng)，為腦組織重建、功能恢復(fù)提供基礎(chǔ)環(huán)境。bFGF是一種血管活性多肽，可能通過(guò)上調(diào)超氧化物歧化酶起到抗氧化作用，減少缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，從而減少組織壞死［6］。郭翠平等在其實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)VEGF、bFGF在缺血預(yù)處理大鼠局灶性腦缺血再灌注區(qū)域表達(dá)明顯增高，缺血面積及缺血程度均減輕，推測(cè)兩者可能對(duì)缺血再灌注鼠神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用［7］。

本文中我們著重研究腦梗死后外周血中VEGF水平變化，通過(guò)在不同條件處理下VEGF的濃度間接反應(yīng)其對(duì)血管新生的影響，以及應(yīng)用丹紅注射液后對(duì)VEGF的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫水浴箱(HG-75-4，南京)、酶標(biāo)分析儀(PHOMO，鄭州安圖生物工程有限公司)、離心機(jī)(3K15，德國(guó)Sigma公司)、注射用丹紅注射液，菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格10 ml。人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(吉林恒晟生物科技有限公司生產(chǎn)，長(zhǎng)春)。

1.2 病例選擇

隨機(jī)選取于本科住院的腦梗死患者60例，發(fā)病均在48 h內(nèi)，全部病例均符合1995年第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的《各類腦血管疾病的診斷要點(diǎn)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭部CT或MRI檢查證實(shí)，排除顱內(nèi)出血及其他顱內(nèi)疾患。另除外下列情況:(1)年齡＜18歲的住院患者;(2)嚴(yán)重肝腎功能障礙;(3)全身出血傾向或出血性疾病;(4)過(guò)敏體質(zhì)患者;(5)處于妊娠期或哺乳期的婦女。共入選60例，其中男37例，女23例。年齡43～82歲，平均57.02 ±10.21 歲。

1.3 治療方法

將入選的60例新發(fā)腦梗死患者隨機(jī)分為丹紅注射液治療組與對(duì)照組，治療組30例(男21例，女9例，平均年齡55.67±9.87歲)，對(duì)照組30例(男20例，女10例，平均年齡 57.48 ±11.33 歲)，其中治療組使用常規(guī)治療，即改善循環(huán)，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，抗血小板聚集治療，并加用丹紅注射液40 ml溶解于0.9%生理鹽水100 ml中，每日1次靜脈輸注(輸注時(shí)間為1 h);而對(duì)照組使用常規(guī)治療。兩組均以7～12 d為1個(gè)療程，在用藥前24 h和用藥周期內(nèi)，嚴(yán)禁使用ACEI類降壓藥物。兩組患者高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥等危險(xiǎn)因素?zé)o明顯差異，具有可比性，并均對(duì)上述疾病進(jìn)行治療。

1.4 樣品的提取及保存

分別于入院后2 d與治療12 d后采靜脈血(用EDTA抗凝)，經(jīng)離心后將上層清夜即血漿分離出來(lái)，放入－20℃冰箱保存，樣品血漿于實(shí)驗(yàn)前24 h內(nèi)放入2～8℃冰箱保存，于實(shí)驗(yàn)前0.5～1 h取出在室溫下擱置，以備檢測(cè)血漿中VEGF的含量，進(jìn)行比較。

1.5 檢測(cè) VEGF

操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行(采用雙抗體夾心ELISA法)。(1)實(shí)驗(yàn)前30 min取出試劑盒，以平衡至室溫(20～25℃)。(2)取出所需板條，剩余密封放回4℃冷藏。配置洗滌液(濃縮洗滌液與蒸餾水1∶30倍稀釋)。(3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔10孔，在第1孔、第2孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，然后在第1孔、第2孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻，然后從第 1 孔、第 2 孔中各取 100 μl分別加到第3孔和第4孔，再在第3孔、第4孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻，然后從第3孔和第4孔中先各取50 μl棄掉，再各取50 μl分別加到第5孔、第6孔，然后在第5孔、第6孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻，然后從第5孔、第6孔中各取50 μl分別加到第7孔、第8孔，再在第7孔、第8孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻，然后從第7孔、第8孔中各取50 μl分別加到第9孔、第10孔，再在第9孔、第10孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻，然后從第 9 孔和第 10 孔中各取 50 μl棄掉。使之各孔體積均為50 μl。(濃度分別為900 pg/L、600 pg/L、300 pg/L、150 pg/L、75 pg/L)。(4)加樣:分別設(shè)空白對(duì)照孔(空白對(duì)照孔不加樣品和酶標(biāo)抗體工作液，其余各步操作相同)和待測(cè)樣品孔。在待測(cè)樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μl，然后再加樣品10 μl，(樣品最終稀釋了5倍)。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕搖動(dòng)混勻。(5)用封板紙封板后置37℃ 30 min。(6)洗板:小心揭掉封板紙，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，向?yàn)V紙印干。(7)每孔加入酶標(biāo)抗體工作液50 μl，輕輕搖動(dòng)混勻。(8)用封板紙封板后置37℃ 30 min。(9)洗板:小心揭掉封板紙，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，向?yàn)V紙印干。(10)每孔先加入底物液 A 50 μl，再加入底物液 B 50 μl。(11)將反應(yīng)板充分混勻后置37℃暗處反應(yīng)15 min。(12)每孔加入終止液50 μl，混勻，終止反應(yīng)。此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。(13)以空白孔調(diào)零，在45 nm處測(cè)吸光值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.6 測(cè)定結(jié)果計(jì)算與判斷

(1)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為900 pg/L、600 pg/L、300 pg/L、150 pg/L、75 pg/L之 OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將濃度作為X軸(對(duì)數(shù)軸)，OD值作為Y軸(線性軸)。(2)根據(jù)樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)人VEGF含量，再乘以稀釋倍數(shù)5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析后得出:治療前兩組VEGF水平相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，治療后兩組VEGF水平相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1、圖 1)。

表1 兩組治療前后VEGF水平變化(pg/mg，)

表1 兩組治療前后VEGF水平變化(pg/mg，)

組別VEGF治療組(30例) 對(duì)照組(30例)治療前治療后72.2 ±9.71 74.5 ±16.85 70.9 ±6.31 71.7 ±11.26

圖1 兩組治療前后VEGF水平變化

3 討論

3.1 腦梗死與VEGF

3.1.1 VEGF對(duì)血管生成的影響 VEGF是影響血管生成一個(gè)關(guān)鍵的因素，腦梗死后VEGF介導(dǎo)血管生成的治療潛力逐漸得到重視，一些研究顯示VEGF是血管生成過(guò)程、神經(jīng)保護(hù)和腦缺血后神經(jīng)再生最重要的生長(zhǎng)因子。腦梗死后VEGF表達(dá)上調(diào)，低氧依賴性HIF-1、HIF-2也參與VEGF表達(dá)，低氧是增加VEGF表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵［8］。缺血性梗死后，VEGF和VEGFRs在梗死部位、缺血半暗帶區(qū)以及較遠(yuǎn)處皮質(zhì)區(qū)域都有明顯表達(dá)，其中主要是通過(guò)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和小腦，也通過(guò)海馬神經(jīng)元和齒狀回(DG)和星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。VEGF的兩個(gè)受體VEGFR-1和VEGFR-2在缺血48 h后先后在缺血灶周圍及缺血區(qū)表達(dá)。此外，在缺血再灌注后大約3 d VEGF-C和VEGFR-3在CA1和齒狀回開始表達(dá)，并至少持續(xù)14 d，這種改變與缺血性損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。腦梗死后缺血周圍血管會(huì)再生，事實(shí)上已經(jīng)證實(shí)腦梗死后VEGF明顯加速了血管生成，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［9，10］。此外，Harrigan等［11］發(fā)現(xiàn)在心室內(nèi)緩慢注入VEGF165與血管密度增加呈劑量依賴關(guān)系，VEGF有增強(qiáng)血管生成的作用是由VEGF通過(guò)下游VEGFR-2介導(dǎo)而生成。Sun等［5］證實(shí)在缺血再灌注的1～3 d腦室通過(guò)VEGF調(diào)節(jié)可以減小梗死面積，提高神經(jīng)系統(tǒng)功能，增加并延長(zhǎng)齒狀回(DG)和腦室下區(qū)(SVZ)神經(jīng)元新生。然而，VEGF在腦缺血中的急性效應(yīng)極其復(fù)雜的，這種神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚未完全闡明。有研究證實(shí)VEGF神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，VEGFR-2與VEGF提高內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元生存的能力密切相關(guān);VEGFR-1則與VEGF減小腦梗死面積，減輕腦水腫有關(guān)［12］;下游的受體水平、信號(hào)PI3-K/Akt和ERK1/2等因素均有助于提高VEGF神經(jīng)保護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧和葡萄糖不足時(shí)，VEGF通過(guò)VEGFR-2和PI3-K途徑減少細(xì)胞死亡。

3.1.2 VEGF對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響 VEGF作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子除具有促進(jìn)血管生成的作用，還可抑制細(xì)胞凋亡、刺激神經(jīng)再生，并對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化有直接促進(jìn)作用，這種作用可能與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligoderndrocyte precursor cells，OPC)有關(guān)。OPC在不同環(huán)境下可以分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)、甚至可以分化為神經(jīng)元［13］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，而少突膠質(zhì)細(xì)胞則是神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成細(xì)胞，在信息傳遞及整合方面起著重要作用。此外，OPC能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。腦缺血缺氧后，VEGF在腦缺血區(qū)促進(jìn)血管生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞存活的同時(shí)還通過(guò)FLK-1促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，并通過(guò)Nocth信號(hào)通路對(duì)OPC起到促進(jìn)增殖作用，為其遷移到受損部位以完成修復(fù)功能提供前提條件。VEGF能直接刺激體內(nèi)外的神經(jīng)發(fā)生［14～16］，VEGF則能上調(diào)這些區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生［2，5］。事實(shí)上，在攜帶VEGF基因的鼠實(shí)驗(yàn)中，腦梗死1～4 w室管膜下區(qū)神經(jīng)再生明顯增加，成神經(jīng)細(xì)胞鏈從室管膜下區(qū)一直擴(kuò)展到缺血半暗帶層，腦梗死2～4 w后大腦皮質(zhì)新生成的神經(jīng)元顯著增加。也有研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒VEGF-1相關(guān)病毒可能通過(guò)提高SVZ區(qū)的神經(jīng)發(fā)生和促進(jìn)神經(jīng)前體遷移到缺血病變周圍組織，進(jìn)而減少梗死病灶的大小并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。VEGF在體外誘導(dǎo)神經(jīng)元增殖研究中需要PLC、PKC、PI3-K、MEK 參與，并進(jìn)一步通過(guò)上調(diào)E2F的表達(dá)促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元的增殖［17］。VEGF可能通過(guò)提高腦缺血后神經(jīng)發(fā)生，對(duì)腦損傷的修復(fù)起到治療作用。

3.2 丹紅注射液與VEGF

本實(shí)驗(yàn)中治療后VEGF均有升高，丹紅治療者較對(duì)照組升高明顯，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明丹紅注射液可以增加缺血性腦卒中患者血液中VEGF的表達(dá)，VEGF含量的增加對(duì)促進(jìn)腦缺血區(qū)血管的新生及神經(jīng)細(xì)胞再生發(fā)揮了一定的積極作用。丹紅注射劑由丹參、紅花提煉而成，主要成分有丹參酮、丹參酚，紅花黃醇酮、紅花黃色素等，前兩者有降低血栓烷素A2水平、抗血小板聚集、降低血漿中D-二聚體及纖維蛋白原從而降低血液黏度［18］及紅細(xì)胞聚集指數(shù)，改善微循環(huán)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成、清除自由基作用;后兩者則有抗凝溶栓、改善ATP酶活性、刺激組織纖溶酶活性物質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解活性進(jìn)而起到防止血栓形成及促進(jìn)血栓溶解作用［19］。目前丹紅注射液已廣泛應(yīng)用與臨床，治療心腦血管等疾病，臨床療效觀察發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者在早期應(yīng)用該藥后，患者神經(jīng)功能恢復(fù)及預(yù)后均有提高。席曉華等研究中證實(shí)丹紅注射液有促進(jìn)血管新生、側(cè)枝循環(huán)擴(kuò)張、抗血小板聚集、降低血栓烷素B2水平、抗血栓形成、抗氧化和清除自由基、提高細(xì)胞耐缺氧能力等作用，譚來(lái)勛等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)大鼠腦梗死區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、突觸數(shù)目增加，從而達(dá)到促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用。我們的試驗(yàn)結(jié)論也證實(shí)使用丹紅注射液后患者血中VEGF水平明顯提高，間接證實(shí)丹紅注射液可能在缺血性腦卒中患者血管再生及神經(jīng)功能恢復(fù)中發(fā)揮了積極作用。

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