肢體遠端缺血預處理延緩腦卒中DWI上病灶出現(xiàn)的機制研究

陳秋雁， 吳富淋， 繆紹維， 魏鼎泰

缺血性腦卒中有著極高的致死率和致殘率，迄今為止，尚未找到十分有效的辦法治愈它。遠端缺血預處理(RPC)的神經(jīng)保護作用明確，肢體遠端缺血預處理(Limb remote preconditioning，LRP)作為一種低創(chuàng)性的預處理方式，是目前最常用的用于研究RPC心臟及神經(jīng)保護作用的預處理方法之一［1］，但目前對其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制研究甚少。課題組前期的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRP不僅能夠減小還能延緩腦缺血大鼠DWI上病灶的出現(xiàn)［2］，說明LRP能夠減輕缺血引起的腦水腫，為進一步探索其相關(guān)機制，現(xiàn)對與腦內(nèi)水分子運輸密切相關(guān)的水通道蛋白4(AQP4)進行檢測，以間接探索肢體遠端缺血預處理的神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 成年雄性SD大鼠(260～330 g)54只，購自上海伊萊克斯動物實驗中心，隨機分為3組:(1)缺血對照組24只:a亞組12只用于不同時間點(1 h、3 h、12 h、24 h)各項指標的Western blot檢測;b亞組12只用于不同時間(1 h、3 h、12 h、24 h)點各項指標的免疫熒光檢測。(2)LRP組24只，亞組同組(1)。(3)假手術(shù)組6只，分別用于Western blot檢測和免疫熒光檢測，每亞組3只。

1.2 大鼠腦缺血模型的制作及LRP方法 大鼠腦缺血模型的制作及LRP處理方法如前文所述［2］:大鼠術(shù)前24h禁食不禁水;10%水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)，固定，腦缺血模型組分離出左側(cè)股動脈，暴露90 min;切開頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸外動脈近端近分叉處插入預先浸泡過2%肝素的線栓(直徑0.24 mm)，松開頸內(nèi)動脈夾，插入線栓直至距離分叉處約1.8～2.0 cm，1 h后拔出，結(jié)扎頸總動脈防止出血，縫合切口。LRP組分離左下肢股動脈，動脈夾夾閉15 min，恢復再灌15 min，反復3個循環(huán)，后續(xù)腦缺血的誘導方法同前。術(shù)中保持大鼠體溫在37±5℃。假手術(shù)組只進行相同的麻醉及皮膚切開曝露，而不做任何血管夾閉。

1.3 免疫熒光和共聚焦 麻醉大鼠，PBS和4%多聚甲醛行心臟灌注，快速斷頭取出腦組織，預冷PBS漂洗。鼠腦置于4%多聚甲醛溶液中固定4～6 h，后置于30%蔗糖溶液中沉底，連續(xù)冠狀切片，片厚40 μm，連續(xù)5張片取1張，每一標本各取20張備用。免疫熒光法分別檢測缺血組和LRP組各時間點以及假手術(shù)組AQP4(1∶100;Santa Cruz Biotechnology;SC-20812)表達情況，而后進行共聚焦顯微鏡觀察。AQP4定位檢測:AQP4與星形膠質(zhì)細胞標志物 GFAP(1∶100;Santa Cruz Biotechnology，SC-56395)共染;AQP4與微血管內(nèi)皮細胞標志物CD31(1∶100;Santa Cruz Biotechnology，SC-46694)共染;AQP4與神經(jīng)元標志物MAP-2(1∶100;Santa Cruz Biotechnology，SC-56561)共染。定位均用的是LRP組1 h冰凍切片。

1.4 Western Blot 大鼠麻醉后4℃ PBS經(jīng)心臟沖洗，斷頭取腦，分離出右側(cè)半腦的梗死區(qū)，加入RIPA裂解液研磨，勻漿，離心收集蛋白樣品。BCA法對蛋白進行定量。SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。經(jīng)漂洗和封閉后，加入兔抗一AQP4抗體(1∶200)孵育，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(北京中杉，ZB-2301)，顯影后，經(jīng)掃描儀掃描，利用Image J圖像分析軟件對各條帶進行灰度分析，結(jié)果以平均灰度值即平均光密度(IOD)表示。

2 結(jié)果

2.1 Western blot及灰度分析示LRP能夠上調(diào)AQP-4的表達 AQP4是腦內(nèi)表達最多的水通道蛋白，主要負責將膠質(zhì)細胞及細胞外的水分子運輸至血管內(nèi)。Western blot結(jié)果顯示在缺血對照組中，AQP4的表達隨著時間的延長而下降，但在實驗組中，這種表達得到了逆轉(zhuǎn)，說明LRP能夠上調(diào)AQP-4的表達(見表1、圖1、圖2)。

表1 各組大鼠AQP4 Western Blot結(jié)果的灰度分析數(shù)據(jù)比較

圖1 Western blot結(jié)果顯示AQP4的表達隨著缺血時間的延長而降低。但經(jīng)過LRP處理后，AQP4的表達上升，并且有隨時間延長逐漸上升的趨勢

圖2 灰度分析結(jié)果表明:AQP4的表達隨著缺血時間的延長而降低(A)。但經(jīng)過LRP處理后，AQP4的表達上升，并且有隨時間延長逐漸上升的趨勢(B)。與 sham比較*P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P ＜0.001;n=3/group

2.2 共聚焦免疫熒光結(jié)果顯示LRP各組中的AQP4表達量較假手術(shù)組及缺血對照組增多 免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，LRP各組腦內(nèi)AQP4的表達量較缺血組和假手術(shù)組明顯增多(見圖3A)。

2.3 AQP4定位共染結(jié)果 定位顯示AQP4與GFAP發(fā)生了共染，并與CD31有少量共染，提示了AQP4在星形膠質(zhì)細胞上的表達及在血管內(nèi)皮細胞上的少量表達(見圖3B、圖3C)。AQP4與神經(jīng)元標志物MAP-2之間無共染(見圖3D)。

3 討論

LRP對腦卒中的神經(jīng)保護作用明確，但目前國內(nèi)外對其作用機制的相關(guān)研究寥寥無幾。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)腦缺血組大鼠在1h的檢測時間點就已經(jīng)出現(xiàn)了DWI上的異常信號，LRP組大鼠多出現(xiàn)在缺血3h以后，并且病灶面積大大減小，而說明LRP能通過減輕或抑制缺血所致的腦水腫，從而延長治療時間窗［2］。這對LRP的神經(jīng)保護作用機制的探討提供了一個新方向，所有能夠引起彌散受限的因素均應(yīng)被納入考慮范圍。

圖3 (A)免疫熒光共聚焦檢測結(jié)果顯示LRP各組中的AQP4表達量較假手術(shù)組及缺血對照組增多，并呈現(xiàn)出隨時間延長而逐漸增加的趨勢(Scale bar，50 μmol/L)。(B)AQP4與 GFAP發(fā)生了共染(Scale bar，25 μmol/L)，提示AQP4在星形膠質(zhì)細胞上的表達。(C)AQP4與CD31有少量共染，提示了AQP4在血管內(nèi)皮細胞上的少量表達(Scale bar，25 μmol/L)。(D)AQP4與神經(jīng)元標志物MAP-2之間無共染(Scale bar，50 μmol/L)。

此次研究中，我們證實了AQP4的表達在腦缺血后降低，這與之前的報道一致［3～8］，但是目前對于AQP4在腦缺血后的表達水平存在爭議，有不少研究證實 AQP4 在腦缺血后表達升高［9～12］，出現(xiàn)這一矛盾的結(jié)果可能與建模方法、動物的選擇及檢測時間點的不同有關(guān)，目前尚沒有一種建模方法能完全模擬腦卒中，這為研究工作的展開帶來了很大的困難。AQP4是腦內(nèi)主要表達的水通道蛋白［13］，水通道蛋白的降低會直接導致了水分子向胞外運輸?shù)臏p少以及細胞腫脹［14］，而事實上，AQP4在腦卒中的具體功能十分復雜，首先對于腦水腫的兩種類型AQP4表現(xiàn)出不同的作用，在細胞毒性腦水腫中，AQP4的缺失能夠延緩水分子進入腦內(nèi)，而在血管源性腦水腫中，AQP4的缺失則使腦實質(zhì)內(nèi)的水分清除水平下降［13］，因此有學者認為在缺血后初期AQP4的表達水平應(yīng)升高才符合邏輯，其實不然，Zeng XN等［15］通過比較AQP4基因敲除的小鼠和正?；蛐偷男∈笏⒌拇竽X中動脈栓塞腦缺血模型，證實了AQP4在I/R病理損傷機制中的重要作用，表現(xiàn)在AQP4基因敲除的小鼠在腦缺血后死亡率大大增加、行為病理學缺陷更加明顯、梗死面積大大增加，同時更有意義的是，該研究發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除小鼠的星形膠質(zhì)細胞的腫脹較正?；蛐偷男∈蟾用黠@，可見在活體模型中AQP4表達水平的升高并不與星形膠質(zhì)細胞的腫脹乃至細胞毒性水腫成正比，而缺血損傷的病理機制中，星形膠質(zhì)細胞的腫脹也并不一定需要伴隨著AQP4水平的升高。實際上缺血后AQP4表達水平的降低能夠直接導致AQP4在星形膠質(zhì)細胞上的去極化分布，AQP4的這種去極化分布在缺血初期是機體在缺血后發(fā)生的一種自發(fā)性的反饋保護機制，用來抵制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腫脹從而抑制水腫形成并降低缺血造成的損害［7］，Amiry-Moghaddam等［8］的研究也得出相似的結(jié)論，即缺血后AQP4表達水平的降低有利于減輕細胞毒性腦水腫，但缺血后星形膠質(zhì)細胞突觸上尚存在一種特殊類型的水通道蛋白即與α-互生蛋白依賴的AQP4，這種類型的AQP4表達水平穩(wěn)定，介導著腦實質(zhì)和血管內(nèi)的雙向水分子的流通。但缺血導致的AQP4的水平降低始終弊大于利，AQP4不僅僅只在水分子的流通上起作用，AQP4還被證實能夠參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的遷移和神經(jīng)元的應(yīng)激性［13］。這些復雜的作用均提示AQP4在細胞毒性水腫、血管源性水腫及腦缺血損傷中的重要作用。

此次研究結(jié)果表明LRP能夠上調(diào)缺血后的AQP4表達水平，AQP4表達的升高機制很可能是LRP通過MAPK信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)［16］，我們推測高表達的AQP4主要參與了腦內(nèi)水分子的清除，抑制后續(xù)的血管源性水腫的發(fā)生，同時也參與抵抗細胞毒性腦水腫，這個看似矛盾的結(jié)果更從側(cè)面反應(yīng)出AQP4在腦卒中中的多重的復雜作用機制。AQP4的具體功能與其表達部分有關(guān)，AQP4主要表達在膠質(zhì)細胞與毛細血管內(nèi)皮細胞接觸的足突膜上［17］，AQP4同時也高表達于鄰近軟腦膜的膠質(zhì)細胞、腦室室管膜上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及脈絡(luò)叢上皮細胞等［18］。星形膠質(zhì)細胞中AQP4的分布具有極性，在腦缺血后，可以觀察到AQP4在星形膠質(zhì)細胞中的去極化［7］，而在軟腦膜、室管膜細胞、脈絡(luò)叢上皮細胞的AQP4分布與腦脊液分泌和重吸收部分一致，此外，分布于海馬、小腦，腦干神經(jīng)核團和部分皮質(zhì)神經(jīng)元上的AQP4主要參與調(diào)節(jié)細胞外間隙大小及細胞外間隙的K+濃度［19］。在此次研究結(jié)果中，我們僅利用LRP 1 h組的切片對高表達的AQP4進行初步定位，定位顯示AQP4主要表達在星形膠質(zhì)細胞上，而在血管內(nèi)皮細胞膜上有少量的表達，但這并不能否定高表達的AQP4能夠不參與抑制細胞毒性水腫。高表達的AQP4很可能通過負反饋調(diào)節(jié)機制導致AQP4的去極化重新分布從而發(fā)揮抑制細胞毒性水腫的作用，而1 h的檢測時間點可能正處于重新分布的時期內(nèi)，因而仍表現(xiàn)出AQP4在星形膠質(zhì)細胞上的多量表達。因此，進一步明確LRP后AQP4表達部分的變化對探討LRP的神經(jīng)保護作用十分重要。高表達的AQP4也可能通過促進星形膠質(zhì)細胞的遷移，增加神經(jīng)元的應(yīng)激耐受性來發(fā)揮抗水腫作用。但是其具體機制有待進一步證實。此外，在預期結(jié)果中，我們推測AQP4在周圍血管細胞膜上的表達增多，但是通過與CD31的共染只得到少量的共染表達。推測出現(xiàn)此結(jié)果的原因有:(1)1 h時間點AQP4的多量表達尚不明顯，或正處于重新分布的過程中，因此不被檢測，通過重新分布后，周圍血管細胞內(nèi)皮上的AQP4表達量逐漸增多，促進腦內(nèi)水分子的清除，從而減輕后續(xù)的血管源性水腫的產(chǎn)生。(2)CD31作為一種反應(yīng)血管內(nèi)皮完整性的指標，其表達水平在缺血發(fā)生后是降低的［7］，而LRP是否能夠?qū)D31產(chǎn)生影響尚不明確。

綜上，LRP很可能通過上調(diào)AQP4的表達來減輕腦水腫。RPC對腦缺血的保護作用明確，具有極大的臨床應(yīng)用潛質(zhì)，只有深入全面得了解其機制，才能充分發(fā)揮它的臨床應(yīng)用價值。相信不久的將來，在RPC原理上建立的新技術(shù)能成為腦卒中的克星，造福全人類。

［1］Wei D，Ren C，Chen X，et al.The chronic protective effects of limb remote preconditioning and the underlying mechanisms involved in inflammatory factors in rat stroke［J］.PLoS One，2012，7(2):30892.

［2］魏鼎泰，陳秋雁，吳富淋，等.肢體遠端缺血預處理對抑制缺血性腦卒中的MRDWI研究［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2012，8:691－694.

［3］Amiry-Moghaddam M，Otsuka T.An α-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain［J］.PNAS，2003，100:2106 －2111.

［4］Sato S，Umenishi F，Inamasu G，et al.Expression of water channel mRNA following cerebral ischemia［J］.Acta Neurochir Suppl，2001，76:239－241.

［5］Ke C，PoonWS，Ng HK，et al.Heterogeneous responses of aquaporin-4 in oedema formation in a replicated severe traumatic brain injury model in rats［J］.Neurosci Lett，2001，301(1):21 －24.

［6］Kiening KL，Van Landeghem FK，Schreiber S，et al.Decreased hemispheric Aquaporin-4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats［J］.Neurosci Lett，2002，324(2):105－108.

［7］Steiner E，Enzmann GU，Lin S，et al.Loss of astrocyte polarization upon transient focal brain ischemia as a possible mechanism to counteract early edema formation［J］.Glia，2012，60:1646 －1659.

［8］Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn PD，et al.An alpha-syntrophindependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4):2106－2111.

［9］Lu H，Sun SQ.A correlative study between AQP4 expression and the manifestation of DWI after the acute ischemic brain edema in rats［J］.Chin Med J(Engl)，2003，116(7):1063 －1069.

［10］Kleindienst A，F(xiàn)azzina G，Amorini AM，et al.Modulation of AQP4 expression by the protein kinase C activator，phorbol myristate acetate，decreases ischemia-induced brain edema［J］.Acta Neurochir Suppl，2006，96:393 －397.

［11］Cai SN，Zhu SM.The effects of ketamine pretreated on cerebral edema and AQP4 expression after transient focal cerebral ischemia/reperfusion in rats［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90(23):1648－1651.

［12］Qi LL，F(xiàn)ang SH，Shi WZ，et al.CysLT2 receptor-mediated AQP4 upregulation is involved in ischemic-like injury through activation of ERK and p38 MAPK in rat astrocytes［J］，Life Sci，2011，88(1 －2):50－56.

［13］Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquaporin－4 and brain edema［J］.Pediatr Nephrol，2007，22(6):778 － 784.

［14］Meng S，Qiao M，Lin L，et al.Correspondence of AQP4 expression and hypoxic-ischaemic brain oedema monitored by magnetic resonance imaging in the immature and juvenile rat［J］.Neurosci，2004，19(8):2261－2269.

［15］Zeng XN，Xie LL，Liang R，et al.AQP4 knockout aggravates ischemia/reperfusion injury in mice［J］.CNS Neurosci Ther，2012，18(5):388－394.

［16］Tang Z，Sun X，Huo G，et al.Protective effects of erythropoietin on astrocytic swelling after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation:Mediation through AQP4 expression and MAPK pathway［J］.Neuropharmacology，2012，67:8 －15.

［17］Nielsen S，Nagelhus EA，Amiry-Moghaddam M，et al.Specialized membrane domains for water transport in glial cells:high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain［J］.J Neurosci，1997，17:171 －180.

［18］Rash JE，Yasumura T，Hudson CS，et al.:Direct immunogold labeling of aquaporin-4 in square arrays of astrocyte and ependymocyte plasma membranes in rat brain and spinal cord［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:11981 －11986.

［19］劉 靜.AQP4與腦水腫［J］.中國中醫(yī)藥咨詢，2011，3(14):83－84.