9 種中藥方劑對雞大腸桿菌病的防治效果

趙增成，林樹乾，李桂明，黃中利，傅 劍，宋敏訓(xùn)

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，250023)

雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌引起的局部或全身性感染的傳染病，其特征是引起雞的心包炎、氣囊炎、肝周炎、腹膜炎、滑膜炎、肉芽腫、腸炎、腦炎、皮下水腫、敗血癥等多種臨診病型，并且還常常與病毒和其它細(xì)菌性疾病并發(fā)，造成雞群的高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。多年來臨床上大量使用抗菌西藥對該病進(jìn)行防治，因而導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷增強(qiáng)，為該病的臨床藥物選擇帶來了極大困難[2]。另一方面抗菌西藥的大量使用，還造成了肉蛋食品中嚴(yán)重的藥物殘留，給人類的健康造成了威脅[3]。

中草藥是我國勞動人民幾千年來在與疾病作斗爭中探索發(fā)現(xiàn)的，具有功能作用廣泛、雙向調(diào)節(jié)、副作用少、殘留低、不易產(chǎn)生耐藥性以及資源廣泛、成本低廉、效果持久等特點(diǎn)，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)文化遺產(chǎn)的瑰寶[4-6]。隨著生活水平的不斷提高，人們對健康安全日益關(guān)注，更加崇尚“綠色藥物”、“綠色食品”。因此，充分利用祖國的中醫(yī)藥寶庫，對抗大腸桿菌中藥進(jìn)行篩選研究，創(chuàng)新開發(fā)高效、低毒、無殘留的抗大腸桿菌中藥制劑，對克服大腸桿菌的耐藥性、消除藥物殘留、提高我國畜產(chǎn)品在國際上的競爭力具有十分重要的意義[7]。為了篩選出有效的抗菌復(fù)方中藥，采用雞大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)和雛雞人工感染試驗(yàn)，對9 種經(jīng)典清熱解毒中藥方劑的抗菌效果進(jìn)行了測定?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試中草藥共9 種方劑，分別是黃連解毒湯、白虎湯、清瘟敗毒飲、銀翹散、清營湯、五味消毒飲、桑菊飲、白頭翁湯、雙黃連口服液。各方劑均購自濟(jì)南宏濟(jì)堂藥店。

1.1.2 大腸桿菌菌株E.coli 09－29 株，由本所禽病研究室提供。

1.1.3 營養(yǎng)瓊脂北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物健康海蘭白小公雞，隔離飼養(yǎng)至30～40 日齡。

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取液的制備將9 種中藥方劑，加水適量浸泡1 h，置電爐上煮沸后煎煮1 h，倒出藥液。再同法煎煮一次。合并藥液，置電爐上繼續(xù)蒸發(fā)濃縮，直至濃度達(dá)到1 g/mL（即1 mL藥液相當(dāng)于含生藥l g）。高壓滅菌后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大腸桿菌的培養(yǎng)取大腸桿菌菌種0.2 mL 接種于50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.2.3 體外抑菌試驗(yàn) 參照抗生素效價(jià)測定管碟法進(jìn)行[8]。用滅菌大口吸管吸取已融化的普通營養(yǎng)瓊脂20 mL 注入雙碟內(nèi)，使凝固鋪底。另取普通營養(yǎng)瓊脂融化后冷卻至45 ℃～50℃左右，每100 mL 中加入大腸桿菌新鮮肉湯培養(yǎng)物0.5 mL，混勻后，從中吸取5 mL，注入已鋪底的雙碟中，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，蓋上陶瓦蓋，放置20 min～30 min，使凝固。

在每一雙碟中，均勻放入滅菌鋼管5 個，每一鋼管中分別加入不同稀釋濃度的中藥液300μL，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷細(xì)菌對藥物的敏感性。

1.2.4 雛雞大腸桿菌人工感染試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)：選擇30 日齡的海蘭白健康雛公雞，分別按0.4 mL/只、0.5 mL/ 只、0.6 mL/只、0.7 mL/ 只、0.8 mL/ 只五個劑量組，胸肌注射大腸桿菌肉湯新鮮培養(yǎng)物，6 只/組，測定不同攻菌劑量雞的死亡率，選擇死亡率為50 %左右的攻菌量為正式試驗(yàn)的接種量。

試驗(yàn)分組：挑取相同日齡、體重大小均勻一致的試驗(yàn)雛雞，隨機(jī)分為以下11 組，每組20 只，第1～9 組為藥物試驗(yàn)組；第10 組為陽性對照組，只攻菌，不用藥；第11 組為陰性對照組，不攻菌，不用藥。

攻菌：第1～10 組，按照預(yù)試驗(yàn)中確定的攻菌劑量，每只雞胸部肌肉注射大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物0.5 mL（3.2×109 CFU/mL）。

用藥：攻菌前3 天，各組雞群分別開始灌服以上藥物，1 mL/次，2 次/日，連用7 d。

臨床觀察：細(xì)菌接種后每天觀察各組雞的臨床癥狀，記錄死亡情況，在觀察期內(nèi)對病死雞進(jìn)行剖檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

黃連解毒湯、清瘟敗毒飲、銀翹散、清營湯、桑菊飲、雙黃連口服液在體外均表現(xiàn)出了一定的抑菌作用，而且隨著藥物濃度的增加，抑菌作用明顯增強(qiáng)。白虎湯、五味消毒飲、白頭翁湯則在體外沒有抑菌作用。結(jié)果見表1。

表1 不同方劑煎煮液大腸桿菌體外抑制試驗(yàn)抑菌圈直徑（mm）

2.2 雛雞大腸桿菌人工感染試驗(yàn)結(jié)果

人工感染大腸桿菌1 h 后，各感染組開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，6 h 后雞群開始出現(xiàn)死亡。雛雞精神沉郁，怕冷擠堆，閉目縮頭，羽毛逆立，飲食欲下降或廢絕，重者翅下垂，呆立或癱瘓。

病死雞剖檢：早期死亡病例，腺胃出血，尤其是腺胃與食道交界處、腺胃與肌胃交界處最嚴(yán)重，腺胃、肌胃漿膜出血，個別嚴(yán)重的雞腺胃粘膜與漿膜糜爛，呈青色。肺臟出血嚴(yán)重，呈黑褐色。胸肌注射部位肌肉壞死嚴(yán)重，呈開水燙樣變化。24 h 后死亡雞出現(xiàn)典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎病變。

攻菌后的第7 d，雞群停止死亡。雞群恢復(fù)健康后，統(tǒng)計(jì)各組雞的死亡數(shù)和存活數(shù)，計(jì)算存活率，詳見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，銀翹散、清營湯、桑菊飲、五味消毒飲、雙黃連口服液、黃連解毒湯、白頭翁湯、白虎湯8 個藥物試驗(yàn)組雛雞存活率與陽性對照組相比差異顯著（P <0.05）；清瘟敗毒飲藥物組雛雞存活率與陽性對照組之間差異不顯著（P >0.05）。

表2 大腸桿菌人工感染試驗(yàn)各藥物組雛雞存活率

3 討論

中獸醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，雞大腸桿菌病是一種外感病邪引起的溫?zé)岵?，常表現(xiàn)不同程度的溫?zé)岵∽C，病雞癥狀多逐漸呈現(xiàn)體溫升高，精神萎靡，羽毛松亂，呼吸困難，食欲廢絕，黃白色糞便，肝臟、心包、腹膜有滲出物等病變，最終病雞死亡。符合病邪由衛(wèi)分開始，依次逐漸傳入氣分，深入營分、血分的衛(wèi)氣營血辯證理論，體現(xiàn)了病邪由表入里、由淺入深，病情由輕而重的發(fā)展趨勢。基于上述辨證基礎(chǔ)，臨床上可采取衛(wèi)氣營血辨證的方法對該病進(jìn)行辨證施治，治則以清熱、解毒為主[9]。故本試驗(yàn)全部選用了具有清熱解毒作用的經(jīng)典方劑，試驗(yàn)也表明大多數(shù)清熱解毒中藥方劑對大腸桿菌病確實(shí)具有一定的作用。

五味消毒飲和白頭翁湯雖然在體外抑菌試驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出抗菌作用，但在人工感染試驗(yàn)中卻表現(xiàn)出了較好的效果。清瘟敗毒飲在體外抑菌試驗(yàn)中具有較好的抑菌作用，但在人工感染試驗(yàn)中效果卻不佳。因此中藥體外抑菌效果與體內(nèi)抗菌效果并非完全一致。中藥在疾病防治中，其作用機(jī)理非常復(fù)雜，并不僅僅表現(xiàn)為對病原的直接抑制或殺滅作用。中藥的抗菌作用分為直接抗菌和間接抗菌兩種。直接抗菌就是藥物對細(xì)菌具有直接抑制或殺滅作用，間接抗菌則是中藥通過對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)而起到抗菌作用[10-11]。體外抑菌試驗(yàn)可以幫助我們篩選出新的有效的抗菌單體成分，為研發(fā)新的抗菌天然藥物提供理論基礎(chǔ)。但在大腸桿菌疾病的中藥臨床防治上，我們應(yīng)以中醫(yī)的“整體觀念”和“辨證論治”為核心[12]，更應(yīng)重視臨床療效試驗(yàn)。本試驗(yàn)同時采用兩種方法對抗大腸桿菌中藥進(jìn)行了篩選，所篩選出的中藥抗菌效果將更加確實(shí)。

在雛雞人工感染試驗(yàn)中，許多因素都影響到雛雞的死亡率，其中菌株、攻毒劑量、雛雞品種、日齡、環(huán)境溫度都是非常重要的因素，常常導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。本文4 次人工感染試驗(yàn)中雛雞存活率存在較大差異，可能與雛雞的批次、日齡、環(huán)境溫度不完全相同有較大關(guān)系，但同時也反映了中藥臨床試驗(yàn)重復(fù)性差的弱點(diǎn)。

4 結(jié)論

綜合考慮體外抑菌試驗(yàn)及雛雞大腸桿菌人工感染試驗(yàn)結(jié)果，通過對各藥物組抑菌圈直徑、臨床癥狀、存活率等各項(xiàng)指標(biāo)與攻毒對照組進(jìn)行對比分析，最終表明黃連解毒湯、白虎湯、銀翹散、清營湯、桑菊飲、雙黃連口服液對雞大腸桿菌病具有一定的防治效果，其中銀翹散、清營湯效果最佳。

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