鹽酸氨溴索對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液頭孢噻肟濃度的影響

陳 峰 張?jiān)?張才擎

鹽酸氨溴索對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液頭孢噻肟濃度的影響

陳 峰 張?jiān)?張才擎

目的探討鹽酸氨溴索對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)頭孢噻肟濃度的影響。方法將54只Wister雄性大鼠隨機(jī)分成3組，每組18只，正常對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、鹽酸氨溴索組(C組)，B、C組采用氣管內(nèi)注入博來霉素(5 mg/kg)的方法制作肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，A組氣管內(nèi)灌注生理鹽水。C組每天腹腔內(nèi)注入鹽酸氨溴索35 mg/kg。分別于給藥后第7、14、28天，各組每次取6只大鼠，鼠尾靜脈注射頭孢噻肟(600 mg/kg)后行支氣管肺泡灌洗，灌洗液采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定頭孢噻肟的濃度，并取肺組織做病理觀察。結(jié)果第7天C組BALF頭孢噻肟濃度低于B組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.164)，第14天C組BALF頭孢噻肟濃度上升，C組與B組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。第28天C組銳降，低于B組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126)。結(jié)論鹽酸氨溴索可提高肺纖維化初期BALF中頭孢噻肟的濃度。

肺間質(zhì)纖維化； 鹽酸氨溴索； 頭孢噻肟

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎最常見的一種，其發(fā)病原因不明，呈慢性、進(jìn)行性、不可逆性發(fā)展，通常為致死性肺疾病[1]。其組織病理學(xué)或影像學(xué)表現(xiàn)符合典型的尋常型間質(zhì)性肺炎(usual interstitual pneumonia, UIP)，確診后的中位存活期為2.5～3.5年，生存期短，病死率高。缺血性心臟病、心力衰竭、支氣管癌、感染和肺栓塞是特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者重要的死亡原因[2-9]。

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化并發(fā)感染，可致呼吸功能下降，引起病情加重，動(dòng)脈血氧分壓進(jìn)一步降低，積極控制感染，有利于改善肺功能，降低病死率[10]。

抗菌藥物治療的成功不僅要取決于致病微生物的敏感性，還要依賴感染組織中的藥物濃度，抗菌藥物的濃度在呼吸道感染治療中尤其重要[11]。因此，提高支氣管-肺組織中的抗菌藥物濃度有利于控制感染。文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸氨溴索可提高動(dòng)物及人的正常肺組織中阿莫西林、紅霉素、氨芐青霉素等抗菌藥物的濃度[12-13]。鹽酸氨溴索能否提高肺間質(zhì)纖維化患者肺組織中抗菌藥物濃度，增強(qiáng)療效，改善患者預(yù)后，文獻(xiàn)未見報(bào)道。研究表明支氣管肺泡灌洗技術(shù)是適合于探測(cè)肺組織中抗菌藥物濃度的方法之一，本研究在肺間質(zhì)纖維化大鼠中，采用支氣管肺泡灌洗技術(shù)，探討鹽酸氨溴索對(duì)肺組織中頭孢噻肟鈉的濃度的影響，旨在評(píng)價(jià)鹽酸氨溴索對(duì)提高抗菌素在肺組織中濃度的作用[12]。

材料與方法

一、試劑與儀器

1.動(dòng)物分組與模型制作 ：54只Wister雄性大鼠(清潔級(jí))購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物中心，體重180～220 g，隨機(jī)分成3組每組18只，即正常對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、鹽酸氨溴索組(C組)，B、C組均一次性氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg)，A組氣管內(nèi)灌注生理鹽水，C組每天腹腔內(nèi)注入鹽酸氨溴索35 mg/kg。各組分別于灌注博萊霉素后第7、14、28天，每次取6只大鼠，鼠尾靜脈注射頭孢噻肟(600 mg/kg)后行支氣管肺泡灌洗，取灌洗液采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定頭孢噻肟的濃度。并取肺組織做病理觀察。

2.標(biāo)本取材和處理：10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉、固定后，自頸部分離出氣管，在第三、四氣管環(huán)間剪開氣管，用5.5號(hào)頭皮針(去針頭)作為灌洗管置入管腔1 cm，用絲線結(jié)扎，將氣管與灌洗管固定在一起，防止倒流，灌洗管內(nèi)注入室溫生理鹽水2 ml，反復(fù)沖洗2遍，在灌洗抽注過程中注意速度緩慢，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar fluids, BALF)至試管，灌洗液回收率>70%。灌洗液以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，取上清液存入EP管，-20 ℃冰凍待檢。取出雙肺，用10%甲醛溶液固定1周后待病理檢查。

二、檢測(cè)方法

1. 病理檢查方法：取右肺進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、切片、HE染色、封片，在普通顯微鏡下觀察組織病理改變，評(píng)價(jià)肺泡炎癥及肺纖維化的程度。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):無肺泡炎癥或肺纖維化(-)；輕度肺泡炎癥或肺纖維化(+)，受累面積少于全肺20%；中度肺泡炎癥或肺纖維化(++)，占20%～50%；重度肺泡炎癥或肺纖維化(+++)，受累面積>50%。

2. 液質(zhì)聯(lián)合法測(cè)定肺泡灌洗液頭孢噻肟鈉濃度：①藥品、試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液： 注射用頭孢噻肟鈉(蘇州東瑞制藥有限公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA)，乙醇(色譜純，天津利密歐)，水(娃哈哈純凈水)；②頭孢噻肟鈉儲(chǔ)備液的配制 精密稱取頭孢噻肟鈉10.06 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。

3. 儀器、 液相色譜系統(tǒng)：Agilent1100液相系統(tǒng)(包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī))，美國(guó)Agilent公司。MS/MS系統(tǒng)：Agilent1100Trap VL 型離子阱質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)：Agilent Chemstation a.09.03和Bruker質(zhì)譜軟件，美國(guó)Agilent公司。

4. 色譜條件： Zorbax SB C18分析柱(150×4.6mm I.D.，5μm)，美國(guó)Agilent公司。0.45μm在線過濾器，美國(guó)Agilent公司。流動(dòng)相：甲醇：水(含0.1%乙酸)=30︰70(V/V)，流速：1.0 ml/Min，分流約0.3 ml/min進(jìn)入質(zhì)譜，進(jìn)樣量：5 μl，λ=254 nm。

5. 質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI源)，加熱毛細(xì)管溫度為350 ℃，噴霧氣壓力30psi，干燥氣流量10 L/min。正離子方式檢測(cè)，掃描模式為多反應(yīng)離子檢測(cè)(MRM)。用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z500→440，碎裂電壓為0.8V。

6. 樣品的處理: 量取BALF 100 μl，置5 ml塑料離心管中，加入400 μl甲醇，渦旋振蕩0.5 min，以離半徑8 cm，4000 r/min離心10 min，取上清液5μl進(jìn)行分析。

7. 方法的專屬性: 取10 μg/ml頭孢噻肟鈉甲醇對(duì)照液，離子源為電噴霧離子源(ESI源)，加熱毛細(xì)管溫度為325 ℃，噴霧氣壓力10 psi，干燥氣(N2)流量4 L/min，使用灌注進(jìn)樣方式，流速5 μl/min，在正離子模式下，頭孢噻肟鈉主要生成[M+Na]+(m/z500)。選擇性對(duì)[M+Na]+峰進(jìn)行碎裂產(chǎn)物離子掃描，將頭孢噻肟鈉生成的主要碎片離子(m/z440)作為定量分析的產(chǎn)物離子。

8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線: 精密量取頭孢噻肟鈉儲(chǔ)備液(1.0 mg/ml)適量，加甲醇配成5、10、50 μg/ml的溶液，進(jìn)樣5μl分析。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量(結(jié)果單位μg/ml)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)改變

光鏡下觀察模型組第7天顯示中至重度肺泡炎癥，至第28天僅有輕度肺泡炎癥；鹽酸氨溴索組肺泡炎癥較模型組減輕。模型組第14天開始出現(xiàn)纖維化，進(jìn)行性發(fā)展至第28天達(dá)高峰，見圖1；鹽酸氨溴索組肺纖維化程度較模型組減輕，見圖2。

圖1 模型組第28天鏡下表現(xiàn)(HE×400)

二、各組不同時(shí)間BALF頭孢噻肟濃度的變化

模型組第7天BALF頭孢噻肟濃度增高，至第14天濃度下降，28天有所回升，見表1、圖3。與模型組相比，第7天鹽酸氨溴索組BALF頭孢噻肟濃度降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.164)，見表2。第14天鹽酸氨溴索組BALF頭孢噻肟濃度上升，高于模型組，鹽酸氨溴索組至與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，見表3。第28天C組銳降，低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126)，見表4。

表1 各組大鼠不同時(shí)間BALF頭孢噻肟濃度(μg/ml)

表2 第7天A組、C組BALF頭孢噻肟濃度與B組兩兩比較(μg/ml)

表3 第14天A組、C組、D組BALF頭孢噻肟濃度與B組兩兩比較(μg/ml)

表4 第 28天A組、C組支BALF頭孢噻肟濃度與B組兩兩比較(μg/ml)

討 論

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化并發(fā)感染，可致呼吸功能下降，病情惡化，增加病死率?？垢腥局委煶晒Φ年P(guān)鍵因素之一是感染組織中抗菌藥物濃度，提高肺組織中抗菌藥物濃度有利于控制感染，改善預(yù)后[10-11]。

頭孢菌素是臨床上常用的抗菌藥物，其通過彌散機(jī)制進(jìn)入支氣管肺組織，本實(shí)驗(yàn)選用了頭孢噻肟鈉作為代表藥物。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組第7天(肺泡炎期)BALF中的頭孢噻肟濃度(10.63±2.19μg/ml)明顯高于正常對(duì)照組(6.64±0.32μg/ml)(P=0.001)，這是因?yàn)槟Ｐ徒M肺泡炎癥期血管通透性增加所致[14]；模型組至第14天(纖維化初期)濃度下降，第28天(纖維化期)有所回升，與正常對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

第7天(肺泡炎癥期)，鹽酸氨溴索組BALF中頭孢噻肟濃度(9.09±2.14μg/ml)低于模型組(10.63±2.19μg/ml)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.164)；第8天(纖維化初期)，鹽酸氨溴索組BALF中頭孢噻肟濃度升高(14.39±3.21μg/ml)，高于模型組(8.33±2.34μg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，對(duì)于在纖維化初期氨溴索提高抗菌藥物的濃度的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究；第28天(纖維化期)，鹽酸氨溴索組BALF中頭孢噻肟濃度低于模型組，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.126)。

本研究發(fā)現(xiàn)氨溴索可提高纖維化初期BALF中頭孢噻肟濃度的同時(shí)，還觀察到鹽酸氨溴索減輕纖維化的作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸氨溴索具有良好的抗炎、抗氧化作用，能抑制細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的合成與釋放[17-19]。氧自由基損傷是肺間質(zhì)纖維化發(fā)生一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本研究表明，鹽酸氨溴索可使肺泡炎癥、肺纖維化程度減輕。肺泡炎癥期、纖維化期鹽酸氨溴索組BALF中頭孢噻肟鈉濃度與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，纖維化初期高于模型組，提示纖維化初期鹽酸氨溴索升高BALF中頭孢噻肟鈉濃度與其抗炎、抗纖維化作用有明顯關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽氨溴索可提高纖維化初期BALF中頭孢噻肟濃度，因而鹽酸氨溴索在肺纖維化初期可以改善抗感染治療效果，對(duì)于臨床抗感染治療有參考價(jià)值，對(duì)于鹽酸氨溴索提高支氣管肺泡中頭孢噻肟濃度的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：張大春)

陳 峰，張?jiān)?，張才? 鹽酸氨溴索對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液頭孢噻肟濃度的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2014， 7(5)： 528-531.

Effect of ambroxol on the concentration of cefotaxim in bronchioalveolar lavage fluid on rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

ChenFeng,Zhangyuanxia,Zhangcaiqing

(DepartmentofRespiration,ShandongProvinceQianfoshanHospital,Jinan250014,China)

Zhangcaiqing,Email:freezcq66@163.com

Objective To explore the effect of ambroxol on the concentration of cefotaxim in bronchioalveolar lavage fluid(BALF) on rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods A total of 54 Wister male rats were randomly divided into three groups, including normal control(Group A), model(Group B), ambroxol-treated(Group C). On experimengtal day(day 0), the rats was intratracheally instilled with bleomycin(5mg/kg body weght) or sterile saline, and then treated with the ambroxol(35 mg/kg) or sterile saline intraperitoneally respectively. On day 7, 14, 28 after instillation, six rats of each group were sacrificed and the bronchial alveolar fluids were recovered and the lung were gotted for histopathological examination after injected cefotaxim(600 mg/kg)intravenously. The concentration of cefotaxim in the BALF was assayed by liquid chromatography-mass spectrometry method. Results On 7th day the concentration of cefotaxim in the BALF of ambroxol group was lower than model group. On 14th day the concentration of cefotaxim in the BALF of ambroxol group was higher than model group. The deference between ambroxol group and model group was significant statistically(P=0.000). On 28th day the concentration of cefotaxim in the BALF of Ambroxol group decreased sharply, and was lower than model group(P=0.126). Conclusions Ambroxol can increase the concentration of cefotaxim in the BALF of the primary fibrosis stage.

Pulmonary fibrosis; Ambroxol; Cefotaxim

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2014.05.012

山東省科技攻關(guān)課題(2012GSF11830)

250014 濟(jì)南，山東省千佛山醫(yī)院呼吸科

張才擎，Email：chenfeng9322@sina.com

R563

A

2014-04-17)