內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染促進內(nèi)皮祖細胞移植對大鼠頸動脈新生內(nèi)膜增生的抑制作用

崔斌 丁小涵 趙剛 宋明寶 于世勇 陳劍飛 黃嵐

隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，冠心病的發(fā)病率、死亡率逐年上升，嚴重威脅人類健康。冠狀動脈介入治療因創(chuàng)傷小、患者恢復(fù)快等優(yōu)點在全球范圍廣泛開展，成為冠心病治療的重要手段。然而，術(shù)后支架內(nèi)再狹窄始終困擾著介入醫(yī)師。盡管藥物洗脫支架能夠有效抑制平滑肌細胞的遷移和增殖，但同時也造成了靶血管段內(nèi)皮的修復(fù)不良，繼而引發(fā)遲發(fā)性血栓形成等危險[1]。加速損傷血管再內(nèi)皮化不僅可以促進受損內(nèi)皮修復(fù)，而且能夠有效抑制平滑肌細胞增殖遷移。多項研究證實成體外周血中存在內(nèi)皮祖細胞（EPCs）可參與出生后的血管新生及再內(nèi)皮化進程，并通過旁分泌作用調(diào)節(jié)血管舒張功能[2-3]。然而，成體EPCs數(shù)量有限，多種冠心病危險因素嚴重影響EPCs數(shù)量及功能，這些限制了EPCs自體移植的臨床應(yīng)用[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、他汀類藥物、促紅細胞生成素、雌二醇等可通過上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達促進EPCs動員及內(nèi)皮修復(fù)能力，而eNOS基因敲除或使用一氧化氮合酶（NOS）抑制劑則可阻止上述物質(zhì)對EPCs的有益作用[6-7]。因此，推測eNOS可能在EPCs參與再內(nèi)皮化過程中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過基因轉(zhuǎn)染上調(diào)EPCs的eNOS表達探討eNOS在EPCs參與損傷血管內(nèi)皮修復(fù)過程中的作用。

材料與方法

1.材料：含人eNOS 基因全長的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMSCV-eNOS 由南開大學張德領(lǐng)教授惠贈[8]。細胞株293 由第三軍醫(yī)大學燒傷研究所提供。大鼠淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物公司。優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液購自Hyclone 公司。DiI 標記乙?；兔芏戎鞍祝―iI-Ac-LDL）購自Molecular probe 公司。人纖維連接蛋白、二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶及FITC 標記荊豆凝集素I（FITC-UEA-I）購自sigma 公司。VEGF 購自Pepro Tech 公司。單克隆兔抗人eNOS 抗體購自santacruz 公司。脂質(zhì)體lipofetamine 2000 購自invitrogen 公司。逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購自TOYOBO 公司。免疫組化染色試劑盒購于北京中山生物技術(shù)公司。

2.實驗動物分組：雄性SD 大鼠45 只，體重約300 g，由第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。分為對照組（15 只）、eNOS-EPCs 組（15 只）、GFPEPCs 組（15 只），每組又均分為5 個亞組（n=3），分別進行RT-PCR 檢測、蛋白質(zhì)印跡法檢測、伊文藍染色、目標血管病理學分析和免疫組織化學檢測。其中對照組為損傷未移植的大鼠，eNOSEPCs 組為移植pMCV-eNOS-EPCs 的大鼠，GFPEPCs 組為移植pMCV-GFP-EPCs 的大鼠。

3.大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立[9]：取大鼠頸部正中切口，暴露左側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，暫時阻斷頸總動脈近心端及頸內(nèi)動脈血流，經(jīng)頸外動脈遠心端將1.5 F經(jīng)皮穿刺冠狀動脈腔內(nèi)成形（PTCA）球囊導(dǎo)管送至頸總動脈，1.5 atm（1 atm=101.325 kPa）充盈球囊，重復(fù)回拉3次。

4.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備：將攜帶eNOS基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-eNOS或攜帶綠熒光蛋白（GFP）的空病毒載體pMCV-GFP采用脂質(zhì)體lipofectamine 2000 介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至293包裝細胞。6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集病毒上清液，離心、沉淀、過濾，－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.EPCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定[10]：密度梯度離心法收集大鼠骨髓源性單個核細胞，接種于纖連蛋白包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。采用乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）攝取法及FITC-UEA-I 細胞免疫熒光法對EPCs 進行鑒定，熒光顯微鏡下DiIAc-LDL 和FITC-UEA-I 染色雙陽性細胞為正在分化的EPCs。

6.EPCs 的轉(zhuǎn)染與移植：EPCs 生長至70%融合，分別加入pMSCV-eNOS 或pMSCV-GFP 病毒上清液，再加入終質(zhì)量濃度8 mg/L 的聚凝膠和無血清、無抗生素的DMEM。6 h 后棄去轉(zhuǎn)染液，加入等量DMEM 培養(yǎng)72 h。頸動脈損傷后即刻及24 h，經(jīng)尾靜脈注入2×106個EPCs。

7.RT-PCR 檢 測 血 管 中eNOS mRNA 表達：血管損傷后14 d，取大鼠頸總動脈損傷段血管，按RNA 提取試劑盒提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行RT-PCR，引物由上海生物工程有限公司合成，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。eNOS 的引物序列上游為5'-CACGCTGGAGTGGTTTGC-3'， 下 游 為5'-TGATGCCGGTGCCCTTG-3'；GAPDH 引物序列上游為5'-CGTATCGGACGCCTGGTT-3'，下游為5'-CGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。取10μl PCR 產(chǎn)物，100 V 電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

8.蛋白質(zhì)印跡法檢測損傷血管eNOS 蛋白表達：取大鼠損傷頸總動脈，提取組織蛋白，測定蛋白總濃度。電泳分離、電轉(zhuǎn)、封閉后，加入1 ∶500單克隆兔抗人eNOS 抗體，4℃過夜，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1 ∶1000）孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

9.伊文藍染色：動物處死前30 min 經(jīng)尾靜脈注射伊文藍25 mg/kg。處死動物后，取大鼠損傷頸總動脈，縱剖目標血管段，鏡下觀察剝脫總面積、內(nèi)皮再生面積，Image-pro plus 測定損傷血管總面積和再內(nèi)皮化面積，計算再內(nèi)皮化率（再內(nèi)皮化率=再內(nèi)皮化面積/損傷血管總面積×100%）。

10.目標血管病理學分析：分離大鼠頸總動脈損傷血管段，固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。通過計算機圖像分析軟件測定總管腔面積、殘余管腔面積、血管最大內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積及狹窄程度（狹窄程度=1－殘余管腔面積/總管腔面積）。

11.免疫組織化學檢測血管中eNOS蛋白表達：取目標血管組織石蠟切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)，滴加1 ∶500 單克隆兔抗人eNOS 抗體37℃孵育2 h。辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育20 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、固定。

12.離體頸動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能檢測[11]：取各組損傷血管段及對側(cè)正常血管段浸泡于4℃預(yù)冷的重碳酸鹽緩沖液（K-H 液）中，剪為3 段3 ～4 mm 的血管環(huán)。將血管環(huán)掛于離體器官灌流槽的浴槽中，預(yù)初張力2.0 g，37℃恒溫孵育2 h，每20 min 換液一次，待張力曲線平穩(wěn)后，測定各組血管環(huán)對乙酰膽堿（Ach）的反應(yīng)性。其中損傷未移植組血管環(huán)作為損傷對照，大鼠損傷頸動脈對側(cè)正常血管環(huán)作為正常對照。

13.統(tǒng)計學分析：用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗測得數(shù)據(jù)以x-±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.EPCs 培養(yǎng)及鑒定結(jié)果：分離獲得的骨髓源性單個核細胞呈圓形，折光性好，懸浮于培養(yǎng)液中，48 h 后開始貼壁，逐漸形成梭形內(nèi)皮樣細胞。通過熒光顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I 和DiI-Ac-LDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。

2.eNOS 基因修飾EPCs 移植對損傷血管eNOS 表達的影響：損傷血管組織勻漿中eNOSEPCs 組eNOS 的mRNA 及蛋白表達顯著，GFPEPCs 組及對照組未見eNOS 表達（n=3）（圖1）。免疫組化結(jié)果同樣顯示，eNOS-EPCs 組損傷血管段內(nèi)膜eNOS 表達顯著，GFP-EPCs 組及對照組均未表達eNOS（n=3）（圖2）。

圖1 損傷血管eNOS信使RNA及蛋白表達

圖2 損傷血管組織切片eNOS蛋白免疫組化染色

3.eNOS 基因修飾EPCs 移植對損傷血管再內(nèi)皮化的影響：通過伊文藍染色觀察到損傷對照組血管幾乎完全被伊文藍染成藍色。EPCs 移植組（GFP-EPCs 組及eNOS-EPCs 組）再內(nèi)皮化率較對照組顯著增加［GFP-EPCs 組（46.2±1.8）%比對照組（1.7±0.6）%，P＜0.01；eNOS-EPCs組（58.9±3.2）% 比 對 照 組，P＜0.01，n=3］，eNOS-EPCs 組再內(nèi)皮化率較GFP-EPCs 組增加更為顯著（P＜0.05，n=3）（表1）。

表1 基因修飾EPCs 移植對損傷血管段再內(nèi)皮化的影響（x-±s）

4.eNOS 基因修飾增強EPCs 移植對損傷血管新生內(nèi)膜的抑制作用：對照組可見血管腔內(nèi)新生內(nèi)膜增殖顯著，血管腔狹窄嚴重。與對照組比較，球囊損傷后14 d 無論GFP-EPCs 或eNOS-EPCs 移植均可顯著抑制新生內(nèi)膜的過度增殖，血管腔狹窄程度顯著減輕［eNOS-EPCs 組（0.58±0.05）比對 照 組（1.56±0.21），P＜0.01；GFP-EPCs 組（0.84±0.09）比對照組（1.56±0.21），P＜0.01）；n=3］。eNOS 過度表達可進一步增強EPCs 的抗增殖效應(yīng)［eNOS-EPCs 組（0.58±0.05）比GFPEPCs 組（0.84±0.09），P＜0.05，n=3］（圖3）。

圖3 eNOS基因修飾EPCs移植對損傷血管新生內(nèi)膜的抑制作用

5.eNOS 基因修飾EPCs 移植顯著改善損傷血管內(nèi)皮功能：與正常對照組比較，損傷血管的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)顯著受損。eNOS-EPCs組及GFP-EPCs 組損傷血管對各濃度點Ach 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)均低于正常對照組（P＜0.01，n=3），但顯著高于損傷對照組（P＜0.01，n=3）；兩組之間比較，eNOS-EPCs 組血管舒張反應(yīng)顯著高于GFP-EPCs 組（P＜0.01，n=3）（圖4）。

圖4 eNOS基因修飾EPCs移植對損傷血管內(nèi)皮功能的影響

討 論

血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化、血管損傷性疾病及血管成形術(shù)后再狹窄等疾病共同的病理生理基礎(chǔ)。內(nèi)皮損傷所觸發(fā)的一系列信號級聯(lián)效應(yīng)刺激血管中膜的平滑肌細胞過度增殖、遷移，引起血管新生內(nèi)膜的病理性修復(fù)，導(dǎo)致血管腔狹窄。加速損傷血管再內(nèi)皮化不僅能夠促進受損內(nèi)皮修復(fù)，而且可以有效抑制平滑肌細胞的增殖反應(yīng)。傳統(tǒng)理論認為，血管損傷內(nèi)膜修復(fù)是由鄰近內(nèi)皮細胞增殖遷移完成。自Asahara 首次證實成體外周血中存在EPCs 以來，越來越多的證據(jù)顯示，EPCs兼具干細胞及內(nèi)皮細胞特性，能夠歸巢至血管損傷部位參與損傷內(nèi)膜的修復(fù)過程。因此，EPCs 一度被作為自體細胞移植治療血管損傷性疾病的理想選擇[12]。然而隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)EPCs數(shù)量及功能與冠心病Framingham 危險因素積分呈反向線性關(guān)系。換言之，臨床上需行EPCs 移植治療的冠心病或糖尿病高?；颊邊s因自體EPCs 數(shù)量及功能受損而不能獲益。因此，如何提高此類人群EPCs 的數(shù)量及功能，使移植至體內(nèi)的EPCs 充分發(fā)揮治療作用，成為自體移植EPCs 治療血管損傷性疾病的關(guān)鍵。

一氧化氮合酶（NOS）是一氧化氮（NO）合成的關(guān)鍵酶，其催化生成的NO 具有擴張血管、調(diào)節(jié)血管張力、防止血栓形成、防止動脈粥樣硬化、抑制平滑肌細胞增殖等生物學功能[13]。近來觀點認為，eNOS 在EPCs 的動員、分化及歸巢過程中發(fā)揮重要作用。多項研究證實VEGF、他汀類藥物、雌激素、促紅細胞生成素等可促進EPCs的動員，加速損傷血管再內(nèi)皮化進程。其作用機制均是通過活化Akt 蛋白激酶上調(diào)EPCs 內(nèi)eNOS表達水平發(fā)揮作用。因此筆者推測eNOS 可能在EPCs 參與再內(nèi)皮化過程中發(fā)揮重要作用。若采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將基因治療與EPCs 移植相聯(lián)合，可能有效提高EPCs 的“利用率”。本研究將轉(zhuǎn)染了pMSCV-eNOS 的EPCs 移植于頸動脈損傷大鼠模型，觀察移植細胞在修復(fù)損傷血管內(nèi)皮及血管功能中的作用。通過RT-PCR 及蛋白質(zhì)印跡法檢測血管局部的eNOS 表達，結(jié)果表明，eNOS 基因修飾EPCs 移植組的eNOS mRNA 及蛋白的表達顯著增高。免疫組化提示，eNOS-EPCs 移植組損傷血管段eNOS 表達顯著增強，GFP-EPCs 移植組及對照組不表達eNOS。這些結(jié)果提示，EPCs 可有效攜帶eNOS 基因定向運載到血管損傷部位，合成行使功能的蛋白。此外，本研究組發(fā)現(xiàn)EPCs 移植可顯著抑制新生內(nèi)膜的過度增殖，而eNOS 過表達可進一步加強這種抗增殖效應(yīng)，提示基因修飾EPCs移植可能成為血管增生性疾病新的治療策略。通過伊文藍染色觀察到EPCs 移植可加速損傷血管再內(nèi)皮化，eNOS 基因修飾EPCs 移植的再內(nèi)皮化作用則更加顯著，再內(nèi)皮化面積超過50%。為了進一步驗證eNOS 修飾EPCs 是否在修復(fù)內(nèi)膜的同時改善血管內(nèi)皮功能，本研究組通過對Ach 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPCs 移植可顯著改善內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，eNOS 基因修飾的EPCs 可進一步加強上述血管保護性效應(yīng)。由此，推測基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合細胞移植可能成為治療血管損傷性疾病的新策略。

［1］ Alfonso F, Byrne RA, Rivero F, et al. Current treatment of In-stent restenosis.J Am Coll Cardiol, 2014, 63:2659-2673.

［2］ Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenensis . Science, 1997,275: 964-967.

［3］ Kalka C,Macuda H,Takahashi T, et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97:3422- 3427.

［4］ Bakogiannis C, Tousoulis D, Androulakis E, et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes.Curr Med Chem, 2012, 19:2597-2604.

［5］ Kotlinowski J, Dulak J, Józkowicz A. Type 2 diabetes mellitus impairs endothelial progenitor cells functions.PostepyBiochem,2013,59:257-266.

［6］ Ulrich F, Thomas M. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease. Circulation,2006, 113:1708-1714.

［7］ Hamed S, Brenner B, Roguin A.Nitric oxide: a key factor behind the dysfunctionality of endothelial progenitor cells in diabetes mellitus type-2.Cardiovasc Res,2011, 91:9-15.

［8］ Kong D, Melo LG, Mangi AA, et al. Enhanced inhibition of neointimal hyperplasia by genetically engineered endothelial progenitor cells. Circulation,2004, 109:1769-1775.

［9］ 崔斌，黃嵐，武曉靜，等.內(nèi)皮祖細胞移植對血管內(nèi)膜修復(fù)的影響.中國病理生理雜志，2007，23:625-628.

［10］ 崔斌，黃嵐，宋耀明，等.冠心病患者心局部血管內(nèi)皮生長因子的檢測及臨床意義.中國介入心臟病學雜志，2005，13:380-382.

［11］ 李德，何國祥，唐波，等.BTEB2 反義基因轉(zhuǎn)染對大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)皮修復(fù)的影響.中國介入心臟病學雜志，2005，13:319-321.

［12］ Padfield GJ, Newby DE, Mills NL.Understanding the role of endothelial progenitor cells in percutaneous coronary intervention. J Am Coll Cardiol, 2010, 55:1553-1565.

［13］ Zhang Y, Janssens SP, Wingler K, et al. Modulating endothelial nitric oxide synthase: a new cardiovascular therapeutic strategy. Am J Physiol Heart CircPhysiol, 2011, 301:H634-H646.