防己黃芪湯對(duì)兔肺缺血再灌注后肺水腫的保護(hù)作用

羅 東,張家衡，柯有力

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 胸心外科，武漢 430022)

缺血再灌注后出現(xiàn)的肺急性損傷是肺動(dòng)脈成形、體外循環(huán)等手術(shù)術(shù)后患者肺功能障礙的重要原因之一[1]。急性肺損傷(ALI)一般認(rèn)為多屬中醫(yī)“暴喘”“喘脫”等病證范圍[2]。本實(shí)驗(yàn)通過在體兔肺缺血再灌注動(dòng)物模型,觀察防己黃芪湯對(duì)肺缺血再灌注損傷(Lung ischaemia-reperfusion Injury，LIRI)的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年日本大耳白兔30只，雌雄不拘，體質(zhì)量(2.5±0.5) kg,購(gòu)于武漢市生物制品研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。DW2000型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司)；防己黃芪湯組成為：防己12 g，黃芪15 g，白術(shù)9 g，甘草6 g，使用中藥顆粒沖泡成水性藥液，每毫升藥液含生藥1 g，中藥顆粒由江蘇江陰藥品有限公司生產(chǎn)；超氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào)：20120606)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；伊文思蘭(EB，F(xiàn)luka公司)；二甲基甲酰胺(廣東汕頭西隴化工廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組和處理 30只日本大耳白兔隨機(jī)分為3組(每組10只)。防己黃芪湯組,于術(shù)前連續(xù)7 d灌服防己黃芪湯，2 mL/(kg·d)，對(duì)照組及假手術(shù)組術(shù)前不作干預(yù)。建立肺缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重，經(jīng)耳緣靜脈注射25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉，術(shù)中以0.8 mL/kg間斷給藥維持。頸正中切開，游離氣管，在氣管正中做T型切口,氣管插管、固定，連接動(dòng)物呼吸機(jī)給予機(jī)械通氣，呼吸頻率30次/min，吸呼比1∶1，氧濃度100%，潮氣量10 mL/kg。胸骨旁線縱行切開左胸，切斷左下肺韌帶，游離左肺，由肺門后方繞過阻斷帶，備阻斷肺門用。肝素350 U/kg肝素化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分3組(n=10):防己黃芪湯組術(shù)中于呼氣末時(shí)用阻斷器阻斷左肺門造成左肺缺血1 h后開放阻斷器，左肺恢復(fù)灌注并復(fù)張后觀察3 h；對(duì)照組，阻斷左肺門1 h后開放阻斷器，左肺恢復(fù)灌注并復(fù)張后觀察3 h；假手術(shù)組，開胸后僅游離左肺門并套帶，不阻斷肺門，觀察4 h。

2.2 檢測(cè)指標(biāo) 1)肺含水量測(cè)定：防己黃芪湯組和對(duì)照組在缺血1 h、再灌注3 h，假手術(shù)組在開胸4 h，于近肺門處結(jié)扎并切取部分左肺下葉肺組織，計(jì)算肺含水量:肺組織稱濕重，80 ℃干燥箱中烘干24 h后稱干重，通過公式算出肺含水量。肺含水量=(濕重-干重)/濕重×100%;2)組織學(xué)觀察：上述方法取部分左肺下葉組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度；3)SOD含量測(cè)定：余下左肺組織凍存，按試劑盒說明測(cè)定SOD含量；4)肺血管通透性比較：EB法檢測(cè)肺毛細(xì)血管通透性。各組按2 mL/Kg經(jīng)股靜脈注射2%EB，1 h后取左肺上葉比較肺血管通透性差異：取左肺上葉肺組織約300 mg，吸干血液，按每100 mg濕重組織用1 mL甲酰胺的比例浸泡、置入37 ℃水浴中24 h，5 000 r/min抽提離心后，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算出伊文思蘭含量(μg/g)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肺含水量測(cè)定 防己黃芪湯組和對(duì)照組左肺含水量均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，防己黃芪湯組肺含水量則明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

3.2 肺血管通透性比較 防己黃芪湯組和對(duì)照組左肺組織中伊文思蘭含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而防己黃芪湯組肺組織中伊文思蘭含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05,見表1)。

3.3 肺組織中SOD含量檢測(cè) 防己黃芪湯組和假手術(shù)組中SOD含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，且防己黃芪湯組SOD含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組 別含水量/%伊文思蘭含量/(μg/g)SOD/(NU/mL)對(duì)照組 89.52±0.36△ 182.6±17.7△ 94.32± 9.96△ 假手術(shù)組 75.57±0.22 113.8±11.5 113.52±11.23 防己黃芪組81.89±0.27#△129.3±13.1#△126.34±12.56#△

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，與假手術(shù)組比較，△P<0.05

3.4 肺組織學(xué)觀察 對(duì)照組缺血1 h、再灌注3 h后，動(dòng)物左肺可見肺血管擴(kuò)張充血，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出，并有大量紅細(xì)胞漏出，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。防己黃芪湯組動(dòng)物左肺損傷很輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺水腫程度較對(duì)照組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)僅有少量紅細(xì)胞漏出，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)很少。假手術(shù)組動(dòng)物左肺組織無破壞征象，肺泡壁完整，肺間質(zhì)無水腫，無中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

4 討論

缺血再灌注可導(dǎo)致組織內(nèi)有氧自由基(OFR)大量生成，激活及釋放多種炎性介質(zhì)可使肺脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，引起微血管損傷、通透性增高，細(xì)胞間質(zhì)水腫，ATP酶活性受損,是引起患者呼吸功能下降的主要原因[3]。李玉梅等[4]對(duì)大鼠肺損傷研究過程中證實(shí)炎性介質(zhì)直接參與了肺損傷。本研究在建立兔肺缺血再灌注動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)對(duì)照組兔肺組織經(jīng)歷缺血再灌注后與假手術(shù)組相比可見肺血管擴(kuò)張充血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有大量漿液性滲出及紅細(xì)胞漏出，表明發(fā)生了嚴(yán)重的肺水腫。尋找抑制氧自由基生成、減輕肺水腫等改善缺血再灌注后肺功能的方法是目前亟待解決的難題。

陳建真等[5]認(rèn)為黃芪對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加有改善作用，并有清除氧自由基作用。高妮娜等[6]認(rèn)為黃芪具有免疫增強(qiáng)和免疫抑制的雙向調(diào)節(jié)作用。白玉新等[7]認(rèn)為黃芪有減輕脂質(zhì)過氧化、清除自由基、增強(qiáng)ATP酶活性、抑制腫瘤壞死因子-α等作用。王迪等[8]通過研究黃芪組方對(duì)小鼠免疫功能的影響，證實(shí)黃芪在提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和TNF活性方面起主導(dǎo)作用。有學(xué)者[9]認(rèn)為，黃芪、白術(shù)、甘草組方可補(bǔ)益脾肺之氣，增強(qiáng)肺組織ATP酶活性。黃芪是防己黃芪湯重要成分，SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它可對(duì)抗與阻斷氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原氧自由基造成的細(xì)胞傷害。本研究觀察到,肺缺血再灌注損傷后對(duì)照組SOD含量明顯減少，防己黃芪湯組SOD含量明顯高于對(duì)照組及假手術(shù)組。其結(jié)果提示中藥防己黃芪湯可提高體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，增加清除氧自由基的能力，減輕肺缺血再灌注損傷的程度。

陳 等[10]研究表明，在方劑瓜蔞薤白半夏湯中加黃芪以補(bǔ)氣行氣，能對(duì)抗氧化低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，防己黃芪湯組動(dòng)物肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)僅有少量紅細(xì)胞漏出，肺水腫程度明顯減輕。肺含水量測(cè)定結(jié)果也證實(shí)防己黃芪湯具有減輕肺缺血再灌注后肺水腫的作用。肺組織中伊文思蘭含量測(cè)定亦提示防己黃芪湯組肺血管通透性得到了明顯的改善，也印證了黃芪對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，手術(shù)時(shí)耗傷元?dú)?，肺失宣肅，津液不布，聚液為痰。治療時(shí)應(yīng)以補(bǔ)益肺氣、止咳化痰為法。防己黃芪湯是益氣利水的代表方，出自《金匱要略》，原文：“風(fēng)濕脈浮，身重汗出惡風(fēng)者，防己黃芪湯主之。”組方有防己、黃芪、白術(shù)、甘草等，防己祛風(fēng)濕利小便；黃芪益氣固表扶正以祛風(fēng)濕之邪；白術(shù)健脾益氣，利水燥濕；甘草調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，諸藥合用，扶正祛邪，祛風(fēng)除濕，故宜于氣虛挾濕的病癥。防己黃芪湯功能益氣祛風(fēng)、健脾利水，治療衛(wèi)氣不固，外受風(fēng)邪而致的風(fēng)水、風(fēng)濕證。其配伍特點(diǎn)是益氣與利水并行，標(biāo)本兼顧，重在固本，體現(xiàn)了消補(bǔ)兼施之法。

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