復方苦參注射液對rBMSCs細胞增殖和遷移能力的影響

羅利瓊，胡 林，馮 剛

(1.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院 腫瘤科，武漢 430064；2.武漢市普愛醫(yī)院 腫瘤科，武漢 430033)

目前，越來越多研究示低氧環(huán)境培養(yǎng)能提高骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖能力和遷移能力[1-3]。復方苦參注射液廣泛用于多種晚期腫瘤的治療和惡性胸腔積液治療等方面。在一定濃度藥物和不同氧濃度條件的作用下,BMSCs是否能繼續(xù)存活進而發(fā)揮抗腫瘤的作用顯得很重要。為此，在前期試驗的基礎上，本研究進一步觀察攜帶目的基因的BMSCs在復方苦參注射液作用下和在常氧或缺氧條件下細胞增殖和遷移能力變化情況。

1 實驗材料與方法

1.1 材料 大鼠肝癌細胞株Walker-256細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；rBMSCs為普愛醫(yī)院實驗室構(gòu)建和保存;復方苦參注射液購自購自山西振東制藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對數(shù)生長期的rBMSCs種于96孔培養(yǎng)板,每組設12個復孔。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別加入復方苦參注射液(濃度分別為300、200、100、50、25 μL/mL)，培養(yǎng)6、12、24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT液，37 ℃孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，用酶標儀于570 nm波長下測量OD值。以不含復方苦參注射液組為陰性對照，以空白孔進行調(diào)零。細胞存活率=(加藥組-空白組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.2 ELISA法 取對數(shù)生長期的Walker-256細胞種于24孔培養(yǎng)板，每組設6個復孔，待細胞貼壁完全后將Transwell小室放入24孔，在上室內(nèi)加入不含血清的rBMSCs。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別在復方苦參注射液(濃度分別為300、200、100 μL/mL)培養(yǎng)12、24、48 h后，吸取Transwell小室中的培養(yǎng)液。用ELISA法對上清液中SDF-1進行檢測。室溫顯色后用酶標儀于450 nm處測吸光度值并制成標準曲線，測定各樣本中含量。

1.2.3 Transwell法 取對數(shù)生長期的Walker-256細胞種于24孔培養(yǎng)板，每組設6個復孔，待細胞貼壁完全后將Transwell小室放入24孔，在上室內(nèi)加入不含血清的rBMSCs。置37 ℃常氧或低氧(5%)條件下，分別在復方苦參注射液(濃度分別為300、200、100 μL/mL)培養(yǎng)12、24、48 h后，取出Transwell小室。棉棒輕輕擦去濾膜頂層的細胞。各選擇5個無重疊區(qū)，于高倍鏡(×200)下計數(shù)穿過基質(zhì)膜濾膜底面的細胞數(shù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 細胞存活情況 隨復方苦參注射液濃度增加和處理時間延長，細胞存活率呈逐漸下降趨勢。25 μL/mL和50 μL/mL組在各處理時間段的細胞存活率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。100 μL/mL、200 μL/mL和300 μL/mL組在處理24、48、72 h后細胞存活率與其他組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但三者在處理后72 h的細胞存活率，與48 h組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。100 μL/mL和200 μL/mL組能提高在低氧條件下的細胞存活率，見圖1。

2.2 SDF-1變化情況 在200 μL/mL處理24 h組，上清液中SDF-1含量上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在100 μL/mL和300 μL/mL組，處理12、24、48 h上清液中SDF-1，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下其SDF-1含量較常氧條件下明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.3 細胞遷移情況 200 μL/mL組細胞遷移率與其他組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其余各組間比較無差異(P>0.05)。200 μL/mL處理24 h組，與處理12 h和48 h組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下處理12 h和48 h間比較有差異(P<0.05)；在常氧條件下2組間比較無差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 對照組和實驗組細胞的存活率比較(n=12)

圖2 細胞上清液中SDF-1含量(n=6)

圖3 對照組和實驗組細胞的跨膜遷移率比較(n=6)

3 討論

BMSCs的移植可以用于治療多種肝臟疾病[4-6]，融合目的基因的BMSCs細胞移植療法可能為惡性腫瘤的治療提供一種新的治療手段[7-9]。本實驗室構(gòu)建了表達纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)重要結(jié)構(gòu)域的真核表達載體pCE-GFP質(zhì)粒，并在BMSCs中獲得高效穩(wěn)定表達，其在體外實驗中影響癌細胞的增殖等[10]。復方苦參注射液是以苦參和土茯苓等為原料經(jīng)科學提煉而制成的注射劑，其主要有效成分為苦參堿和氧化苦參堿等。研究證明，復方苦參注射液對多種腫瘤細胞有直接的殺傷作用；減弱多種腫瘤細胞黏附、侵襲和運動能力，抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等方面的作用[1-3,11-14]。BMSCs在體內(nèi)體外復雜條件下細胞生物學行為的變化情況目前是不清楚的。為此，在前期試驗的基礎上，進一步研究BMSCs在復方苦參注射液作用下的細胞增殖和遷移能力的變化情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨復方苦參注射液濃度增加和處理時間延長，rBMSCs細胞存活率呈逐漸下降趨勢。但在100 μL/mL、200 μL/mL和300 μL/mL組處理24 h和48 h后細胞存活率，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；處理72 h和48 h后3組細胞的存活率無明顯差異。進而得出，在低氧條件下，在100 μL/mL和200 μL/mL復方苦參注射液作用下，能提高rBMSCs在較復雜條件下的細胞存活率。在200 μL/mL處理24 h組，SDF-1含量上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；200 μL/mL組在低氧條件下其SDF-1含量較常氧條件下明顯減少(P<0.05)。rBMSCs分泌的SDF-1濃度，在復方苦參注射液作用下和在常氧或缺氧條件下，并未呈現(xiàn)一定的量效關系和時效關系。只有在適當濃度復方苦參注射液作用下，rBMSCs才可能分泌SDF-1。200 μL/mL組細胞遷移率與其他劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義；200 μL/mL處理24 h組，與12 h和48 h組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。200 μL/mL組在低氧條件下12 h組與48 h組能增強細胞的遷移能力。分析可能原因，SDF-1含量在增強rBMSCs細胞向腫瘤細胞遷移能力方面發(fā)揮一定的作用，但不是唯一的因素。短時間的缺氧條件利于rBMSCs發(fā)生遷移，長時間的缺氧條件則不利于rBMSCs發(fā)生遷移。

綜上所述，在適當濃度復方苦參注射液作用下，在低氧條件下能提高rBMSCs在復雜條件下的細胞存活率；能促進rBMSCs分泌SDF-1；短時間的缺氧條件利于rBMSCs發(fā)生遷移。rBMSCs在體內(nèi)體外環(huán)境中各種化療藥物作用下，其細胞增殖和遷移能力等生物特性的變化值得進一步研究。

[1]蔣紅艷,王貴學,唐舒棠.苦參總堿對血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的抑制作用[J].中國藥學雜志,2009,44(13):982-985.

[2]李曉紅,張鐵民.氧化苦參堿抑制MKN-45細胞遷移及其機制的研究[J].實用醫(yī)學雜志,2013,29(1):28-30.

[3]冀潤利,邸瑤,夏時海,等.氧化苦參堿對SW1990細胞MMP-2表達的抑制作用及對細胞侵襲力的影響[J].世界華人消化雜志,2011,19(1):19-24.

[4]Peng L,Xie D Y,Lin B L,et al.Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B:short-term and long-term outcomes[J].Hepatology,2011,54(3):820-828.

[5]Ju S,Teng G J,Lu H,et al.In vivo differentiation of magnetically labeled mesenchymal stem cells into hepatocytes for cell therapy to repair damaged liver[J].Invest Radiol,2010,45(10):625-633.

[6]Li T Z,Kim J H,Cho H H,et al.Therapeutic potential of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated with growth-factor-free coculture method in liver injured rats[J].Tissue Eng Part A,2010,16(8):2649-2659.

[7]Cao Shi-bo,Meng Qing-hai,Jin Peng,et al.Construction and effects of bone marrow mesenchymal stem cells-cytosine deaminase/5-fluorocytosine suicide gene therapy system[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2010,14(27):4964-4969.

[8]Ren C,Kumar S,Chanda D,et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cells producing interferon-alpha in a mouse melanoma lung metastasis model[J].Stem Cells,2008,26(9):2332 -2338.

[9]Myers T J,Granero-Molto F,Longobardi L,et al.Mesenchymal stem cells at the intersection of cell and gene therapy[J].Expert Opin Biol Ther,2010,10(12):1663-1679.

[10]Feng G,Zhang L J,Luo L Q.Anti-tumor Effects of BMSCs Transfected with pCE-GFP on Walker-256 Cells[J].Acta Med Univ Sci Technol Huazhong,2010,40(2):204-208.

[11]劉益均,鄭軍,肖文波,等.氧化苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J].中國癌癥雜志,2010,20(1):22-26.

[12]萬旭英,羅明,賀平,等.苦參堿和氧化苦參堿體外對人肝癌細胞的誘導分化作用[J].中國藥理學通報,2009,25(7):977-979.

[13]姜子瑜,華海清,秦叔逵,等.復方苦參注射液對人肝癌細胞SMMC-7721增殖與細胞周期的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(7):690-692.

[14]孫麗群.復方苦參注射液聯(lián)合化療治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床研究[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(1):53-54.