反相HPLC法同時測定黃芩標準湯劑中黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的含量

朱 琳，孫 紅，陳素娥，劉亮亮

（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院藥學院，山西 晉中 030619）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是在我國臨床上應用最廣泛的中藥材之一[2]。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效。臨床上常用于濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，癰腫瘡毒，胎動不安[1]。黃芩中含有多種活性成分，包括黃酮及黃酮苷類、多糖類、揮發(fā)油類等。其中，黃酮及黃酮苷為其主要成分[3-8]。黃芩的藥理作用主要有抗菌、抗腫瘤、抑制心腦血管疾病、抗過敏、抗氧化、增強機體免疫、抗炎、抗癲癇等[9-14]。

中藥標準湯劑是以中醫(yī)學理論為指導、臨床應用為基礎，參照現(xiàn)代提取方法，經(jīng)過標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。中藥飲片標準湯劑有助于保證臨床用藥的準確和劑量的統(tǒng)一，保障療效的一致性[15-18]。目前，黃芩標準湯劑的相關研究較少，李琦等[19]制備了黃芩飲片標準湯劑，但僅以黃芩苷為指標進行質量評價，并未發(fā)現(xiàn)有多指標同時含量測定的相關報道。因此本研究收集了10批不同產(chǎn)地的黃芩藥材，以《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》為依據(jù)，將其制備成標準湯劑，建立了黃芩標準湯劑中3種成分的含量測定方法，以期為黃芩標準湯劑的質量控制和規(guī)范其臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥10批黃芩藥材由山西某藥企提供（批號分別為TA190092001，TA190082001，TA190088001，TA190090001，TA190083001，TA190085001，TA190084001，TA190089001，TA190087001，TA190086001），并經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院生藥教研室楊翠玲副教授鑒定為黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

1.2 試劑 黃芩苷（純度為97.9%，批號：110715-201821）、漢黃芩苷（純度97.9%，批號：112002-201702）、黃芩素（純度為97.9%，批號：111595-201808）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇和乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司）；其他試劑為分析純[利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學有限公司]。

1.3 主要儀器Agilent 1200液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Agilent ZORBAX XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫程序如下：0～5min，17%～50%A；5～15min，50%A；15～20min，50%～84%A；流速為1 mL/min；檢測波長為270 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素各5 mg，精密稱定，分別置5、10、5 mL量瓶中，甲醇定容，制成濃度分別為1.012、0.503 1、0.998 mg/mL的對照品儲備液。精密量取黃芩苷1.00 mL、漢黃芩苷0.67 mL、黃芩素0.25 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，得到黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素濃度分別為202.40、67.40、49.90 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取黃芩標準湯劑的粉末（過40目篩）約0.3 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加70%甲醇40 mL，稱定質量，超聲處理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足質量，取1mL上清液至10 mL量瓶，甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 分別吸取空白溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL注于高效液相色譜儀，結果供試品溶液色譜圖中的積分峰與混合對照品溶液色譜圖中的積分峰一一對應，空白溶劑色譜圖中沒有出現(xiàn)相應保留時間的峰，表明該方法的專屬性良好。（見圖1）

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0.25、2、4、6、8 mL至10 mL量瓶中，甲醇稀釋，得到一系列濃度的混標溶液（黃芩苷濃度為5.06、40.50、81.00、121.40、161.90 μg/mL；漢黃芩苷濃度為1.685、13.480、26.960、40.440、53.920 μg/mL；黃芩素濃度為1.248、10.000、19.960、29.940、39.920 μg/mL）。分別精密吸取以上6個濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，以各色譜峰峰面積積分值（y）對濃度（x，μg/mL）進行線性回歸，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的標準曲線方程、線性范圍、相關系數(shù)（r）見表1。由表中數(shù)據(jù)可以看出，各指標成分線性關系良好。

表1 指標成分的回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限

2.4.3 定量限與檢測限 把黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素標準溶液均先稀釋到1 μg/mL，再分別按照“2.1”項下色譜條件進樣，計算信噪比，再按照信噪比來進一步計算稀釋倍數(shù)，直到找到信噪比約為3和10的兩個濃度，即可確定檢測限和定量限。（見表1）

2.4.4 精密度試驗

2.4.4.1 儀器精密度 精密吸取上述黃芩苷濃度為40.50 μg/mL混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件，分別連續(xù)進樣6次，檢測各指標成分所對應的色譜峰峰面積，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素對應色譜峰峰面積RSD分別為0.6%、0.4%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 日間精密度 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣3 d，每天進樣3針，檢測各指標成分所對應的色譜峰峰面積，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素對應色譜峰峰面積RSD分別為4.6%、3.9%、3.9%，均＜5%，表明方法日間精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的黃芩標準湯劑，按照“2.3”項下操作制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的峰面積RSD分別為1.9%、2.1%、2.3%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復性試驗 取同一批黃芩標準湯劑，按“2.3”項下供試品溶液制備方法平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件下進樣分析，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的峰面積RSD分別為2.2%、2.1%、4.8%，表明本方法重復性較好。

2.4.7 加樣回收率試驗 按“2.3”項下的供試品溶液制備方法制得供試品溶液，分別準確加入低、中、高濃度的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，每一濃度平行操作3份，計算平均回收率，結果表明該方法準確度良好。（見表2）

表2 黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的回收率

2.5 含量測定 按“2.3”項下的供試品溶液制備方法提取黃芩標準湯劑，按“2.1”項下的色譜條件進樣，各指標成分的含量見表3。

表3 10批黃芩標準湯劑的含量（%）

3 結果與討論

3.1 檢測波長的選擇 供試品溶液在紫外范圍（210～380 nm掃描來確定λmax。結果表明，黃芩苷的最大吸收波長為280 nm，漢黃芩苷和黃芩素的最大吸收波長為270 nm，考慮到漢黃芩苷和黃芩素的含量相對較低，黃芩苷在270 nm下響應也較高，因此把270 nm作為最佳檢測波長。（見圖2）

圖2 各指標成分的最大吸收波長光譜圖

3.2 流動相的選擇 在流動相考察中發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水體系作為流動相時基線漂移嚴重，而甲醇-水作為流動相時基線平穩(wěn)。為改善峰形，減少拖尾，分別考察了水相中磷酸濃度0.05%、0.1%、0.2%時，流動相pH值對色譜參數(shù)的影響。結果表明，水相中磷酸濃度為0.1%時色譜基線較好，指標成分的對稱因子接近1，峰形較好，分離度較高，理論塔板數(shù)較高，因此選擇磷酸的濃度為0.1%。

此外，分別對流速、進樣量和柱溫進行了單因素考察，結果發(fā)現(xiàn)，當流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為30℃時，分離度最大，峰形最好。

3.3 提取溶劑的選擇 本研究分別采用90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、60%甲醇5種不同的溶劑對黃芩標準湯劑進行提取，通過比較指標成分的含量，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取時提取效率最高。然后進一步測定了70%甲醇提取的樣品的殘渣，發(fā)現(xiàn)殘渣中黃芩苷的含量為0.17%，漢黃芩苷的含量為0.036%，黃芩素的含量為0.004 4%，因此可視為70%甲醇提取時提取比較完全。

3.4 提取體積的選擇 按“2.2”項下供試品制備方法，以70%甲醇為提取溶劑，分別考察在30、40、50 mL 3種不同體積下黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的提取效果。通過比較指標成分的含量，發(fā)現(xiàn)溶劑體積為40、50 mL時指標成分含量較大，但相差不多，因此從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇溶劑體積為40 mL。

3.5 提取方法的考察 按“2.2”項下供試品制備方法，以70%甲醇為提取溶劑，分別考察超聲提取和回流提取時黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的提取效果，結果表明，超聲的提取效率與回流提取差別不大，由于回流提取比較復雜、耗費時間長，因此選擇超聲提取。

4 結 論

本研究建立了同時測定黃芩標準湯劑中3種指標成分（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素）含量的HPLC方法，該方法簡單、高效，為黃芩標準湯劑的質量控制提供了一定的參考。由含量測定結果分析可知，10批標準湯劑中3種成分的RSD分別為7.20%、5.85%、28.82%，含量存在一定差異，這可能與藥材本身含量的差異有關。不同產(chǎn)地的地質、水源及氣候條件可能導致黃芩藥材的含量不同，從而導致標準湯劑中指標成分的含量有所差異。因此，在實際生產(chǎn)中，應當注意固定飲片的來源，以保證標準湯劑含量的均一性。