離子對(duì)液相色譜法測(cè)定柴枳四逆散中 辛弗林的含量

邱紅+胡筱梅

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北十堰442008）

[摘要]目的：建立測(cè)定柴枳四逆散中辛弗林含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜條件為Fortis C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（43：57），流速為1.0ml·min-1，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm。結(jié)果：辛弗林在1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為98.0%，RSD 為1.50%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于柴枳四逆散中辛弗林的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]辛弗林；柴枳四逆散；離子對(duì)高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-5200（2014）04-069-03

DOI：10.11876/mimt201404022

Determination of synephrine in Caizhi Sini Powder by Ion-Pair HPLCQIU Hong，HU Xiao-mei.（Department of clinical laboratory, Affiliated Dongfeng Hospital, Hubei Medical University, Hubei Shiyan 442008, China）

[Abstract]Objective：To establish a method for the determination of synephrine in Caizhi Sini Powder. Method：The RP-HPLC system consisting the Fortis C18（4.6×250mm, 5μm）column, the mobile phase consisted of MeOH –KH2PO4 (43: 57), the flow rate was 1.0ml·min-1, the column temperature was 30℃,The UV detector was set at 275nm. Results：The linear response range was 1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）.The average recovery of schisandrin was 98.0%, RSD was 1.50%. Conclusions：The assay demonstrated that the method was simple and accurate, repeatable, it can be applied in determination of schisandrin in synephrine in Caizhi Sini Powder.

[Key words]synephrine；Caizhi Sini Powder；Ion-Pair-HPLC柴枳四逆散為原國(guó)家衛(wèi)生部部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)收載中藥成方制劑[1]，以柴胡、枳實(shí)、白芍、甘草4味中藥所組成。具有疏肝理脾之功效。主要用于熱厥手足不溫，胸脅痞滿(mǎn)，下痢腰痛等癥候。枳實(shí)為方中君藥性苦；辛；寒。歸脾；胃；肝；心經(jīng)。具有，消痰癖，祛停水，逐宿食，破結(jié)胸，通便閉之功效。主要用于積滯內(nèi)停；痞滿(mǎn)脹痛；大便秘結(jié)；瀉痢后重；結(jié)胸等病癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳實(shí)含有豐富的黃酮類(lèi)、維生素、有機(jī)酸、類(lèi)黃酮等成分[2]。枳實(shí)提取物、枳實(shí)注射液及其有效成分對(duì)羥福林（辛弗林）有強(qiáng)心、增加心輸出量、收縮血管、提高總外周阻力，而使左室壓力和動(dòng)脈血壓上升的作用[3]。辛弗林除具有升壓、抗休克作用外，還具有提高新陳代謝、增加熱量消耗、提高能量水平、氧化脂肪、減肥作用[4]。

本方原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，為更確切研究本方劑的藥理作用與枳實(shí)用量的關(guān)系，本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定方中主藥枳實(shí)的活性成分辛弗林的含量，現(xiàn)將具體方法報(bào)道如下。

1儀器與試藥

Dionex-U3000液相色譜儀（德國(guó)Dionex公司，U3000 二極管陣列檢測(cè)器，Dionex Chemeleon色譜工作站），SK5200H超聲波清洗機(jī)（超聲儀器有限公司）；梅特勒MS105DU型電子天平（d=0.01mg）；辛弗林（1110727 - 20 0306，供含量測(cè)定用，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度≥98.5%），甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。柴枳四逆散及陰性空白制劑（自制，規(guī)格：10g/袋）。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

使用電子分析天平，精密稱(chēng)定經(jīng)真空干燥減壓器中減壓恒重干燥的辛弗林適量，加水制成每1ml含36.4μg的溶液。

2.2供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

精密稱(chēng)定本品2.0g，置錐形瓶中，密塞，精密加入50mL甲醇，稱(chēng)定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，通過(guò)聚酰胺柱（60～90目，2.5g，內(nèi)徑為1.5cm，干法裝柱），用水25mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3色譜條件

色譜柱： Fortis C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6g，十二烷基磺酸鈉1.0g，冰醋酸1mL，加水溶解并稀釋至1000mL）（43：57）[5-9]；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，辛弗林理論塔板數(shù)不小于3000，色譜圖見(jiàn)圖1。柴枳四逆散中其他成分對(duì)辛弗林的含量測(cè)定無(wú)影響。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

吸取辛弗林溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混合均勻，辛弗林濃度分別為1.82、3.64、7.28、18.20、29.12、36.40μg·mL-1，分別進(jìn)樣10μL，按以上色譜條件進(jìn)行分析，以辛弗林色譜峰面積（Y）對(duì)辛弗林對(duì)照品濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果： Y=1.2596X-0.0457，r=0.9999，線性范圍為1.82～36.40μg·mL-1。

2.5精密度試驗(yàn)

照“2.3”項(xiàng)下條件準(zhǔn)備色譜分析，連續(xù)測(cè)試同一辛弗林對(duì)照品溶液6次，記錄辛弗林色譜峰面積，結(jié)果顯示辛弗林相對(duì)保留時(shí)間一致，辛弗林色譜峰面積的RSD為1.16%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)精密度好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批柴枳四逆散，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供穩(wěn)定性測(cè)試的供試品溶液，室溫下取該供試品溶液分別在0，2，4，8，12、24h分析測(cè)定，計(jì)算辛弗林色譜峰面積RSD為1.48%，結(jié)果說(shuō)明處理后的柴枳四逆散供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取柴枳四逆散（批號(hào)20110508）6份，按“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供重復(fù)性測(cè)試的供試品溶液，每份柴枳四逆散制備2個(gè)供試品溶液，每個(gè)供試品溶液連續(xù)測(cè)定兩次，記錄辛弗林色譜峰面積，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算辛弗林在柴枳四逆散中的含量，并將所得含量結(jié)果計(jì)算平均含量為1.02mg·g-1，RSD為1.58%。顯示本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好。

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2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測(cè)定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測(cè)定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國(guó)藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過(guò)程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類(lèi)和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿(mǎn)意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類(lèi)化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問(wèn)題。采取預(yù)先過(guò)篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十二冊(cè)[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新編中藥志 (二卷) [M]. 2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：459- 460.

[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對(duì)小鼠胃排空、小腸推進(jìn)功能的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).《中國(guó)藥典》（一部）[S]. 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010，230．

[6]趙宇, 謝培山, 盧平華, 等. 枳實(shí)、 枳殼、 青皮和陳皮等藥材中辛弗林含量測(cè)定研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC測(cè)定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛(ài)玲，王嘉林. HPLC法測(cè)定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測(cè)定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測(cè)定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測(cè)定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國(guó)藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過(guò)程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類(lèi)和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿(mǎn)意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類(lèi)化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問(wèn)題。采取預(yù)先過(guò)篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

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[4]官福蘭, 王如俊. 枳殼中辛弗林對(duì)小鼠胃排空、小腸推進(jìn)功能的影響[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11(11): 1001-1003..

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[7]康四和.HPLC測(cè)定小兒消積止咳口服液中辛弗林、氫溴酸檳榔堿的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛愛(ài)玲，王嘉林. HPLC法測(cè)定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測(cè)定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取柴枳四逆散（批號(hào)：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制備供加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液，按相同色譜條件分析，測(cè)定辛弗林色譜峰面積，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中辛弗林的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定

按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

批號(hào) 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)5批柴枳四逆散中辛弗林的含量測(cè)定，結(jié)果辛弗林的平均含量為1.04mg·g-1。中國(guó)藥典2010年版一部規(guī)定枳實(shí)中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方為復(fù)方制劑，加上制劑過(guò)程中的損耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的標(biāo)準(zhǔn)，用于本制劑的質(zhì)量控制。

4討論

4.1離子對(duì)試劑的選擇

使用HPLC法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。離子對(duì)試劑種類(lèi)和濃度對(duì)分離效果都有較大的影響。辛弗林為弱堿性,在普通色譜柱上不易保留，分離效果很差。選用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑并且加入冰醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相使成酸性獲得較為滿(mǎn)意的辛弗林分離效果。

4.2選用聚酰胺柱層析法制備供試品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基與黃酮類(lèi)化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用。辛弗林分子中羥基的數(shù)目和位置決定了吸附的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾發(fā)現(xiàn)聚酰胺層析流速慢及低分子雜質(zhì)（聚酰胺）混入的問(wèn)題。采取預(yù)先過(guò)篩除去聚酰胺細(xì)粉或與硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子雜質(zhì)的干擾，則在裝柱時(shí)先用10%鹽酸預(yù)洗除去聚酰胺中的小分子雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十二冊(cè)[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

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[8]魏清芳，辛愛(ài)玲，王嘉林. HPLC法測(cè)定木香順氣丸中辛弗林的含量[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鳴, 吳永宗, 朱良輝, 等. 不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷及辛弗林含量測(cè)定[J].中藥材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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