固定化Gibberella intermedia轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸

楊濤，李恒，龔勁松，熊雷，朱小燕，許正宏，史勁松

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

煙酸屬于維生素B系列化合物，是人體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是醫(yī)藥原料和食品添加劑，目前全球市場對(duì)煙酸的需求量預(yù)計(jì)在5.5萬～6萬噸。煙酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法，如氨氧化法、高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、臭氧氧化法等[1]?；瘜W(xué)法生產(chǎn)煙酸時(shí)，反應(yīng)條件苛刻，需要高溫高壓，過程能耗較大，并且會(huì)產(chǎn)生大量的廢氣廢渣等。因此，人們希望能夠采用生物技術(shù)來進(jìn)行綠色制造。生物催化法生產(chǎn)煙酸條件溫和，反應(yīng)過程易于控制，對(duì)環(huán)境的影響小，相比于化學(xué)合成法具有明顯優(yōu)勢(shì)。

腈水解酶在生物合成羧酸方面具有較大的應(yīng)用潛力，目前已有多種腈類化合物可以通過腈水解酶催化合成相應(yīng)的有機(jī)酸[2-3]。到目前為止，盡管已有大量的不同菌屬來源的微生物被報(bào)道具有腈水解酶活性，包括Pseudomonas putida[4]，Bacillus subtilis[5]，Aspergillus niger[6]等，然而多數(shù)研究主要集中圍繞細(xì)菌腈水解酶展開。真菌腈水解酶相比于細(xì)菌腈水解酶具有諸多優(yōu)勢(shì)，如良好的選擇性和溫度穩(wěn)定性等，但目前已開展的真菌腈水解酶相關(guān)研究工作仍然非常有限[7]。

作者實(shí)驗(yàn)室前期成功篩選獲得了一株含有極高腈水解酶活性的真菌Gibberella intermediaCA3-1[8]，該菌株在3-氰基吡啶生物轉(zhuǎn)化合成煙酸的反應(yīng)中表現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。

腈類化合物在純酶催化下能更高效地進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)[9]，但酶分離純化及催化過程中腈水解酶易失活[10]。相比來說，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化則具有更好的穩(wěn)定性，并且轉(zhuǎn)化成本低[11]。而固定化全細(xì)胞則能進(jìn)一步提高生物催化劑的應(yīng)用價(jià)值和使用效率，與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞有利于產(chǎn)物的分離提取，可增加細(xì)胞的重復(fù)利用批次[12-13]，并能提高細(xì)胞對(duì)底物和產(chǎn)物的耐受性，降低生產(chǎn)成本[14]。

包埋法是最為常用的固定化方法[15]，已有多種材料用于腈水解酶產(chǎn)生菌的固定化，包括海藻酸 鈉[16]、瓊脂[17]、卡拉膠[9]、聚丙烯酰胺[11]。G. intermedia是絲狀真菌，是否可以采用上述材料進(jìn)行包埋用于腈類化合物的生物轉(zhuǎn)化，目前國內(nèi)外尚沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。作者利用復(fù)合材料固定化方法克服單一材料固定化細(xì)胞保留活力低、機(jī)械強(qiáng)度差等問題，增強(qiáng)固定化細(xì)胞的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

G. intermediaCA3-1，由作者實(shí)驗(yàn)室篩選獲得，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 4903。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

試劑材料：3-氰基吡啶、煙酸（純度≥98%），Sigma公司；海藻酸鈉、殼聚糖、聚乙烯醇、氯化鈣、硼酸、三聚磷酸鈉、己內(nèi)酰胺等主要試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭唤湍阜酆推咸烟菫樯燃?jí)試劑。

主要設(shè)備：DHZ-DA型恒溫?fù)u床，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；電子天平，美國SARTORIUS；高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Multitron培養(yǎng)振蕩器，瑞士INFORS HT；立式冷凍高速離心機(jī)，日本日立公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01，蔗糖30。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：磷酸二氫鉀2.72，硫酸亞鐵0.014，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化鈉1.16，己內(nèi)酰胺3.39，充分溶解后調(diào)pH值為7.0。

上述培養(yǎng)基均在121℃、20min進(jìn)行滅菌處理。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)與菌懸液制備

G. intermediaCA3-1培養(yǎng)：將CA3-1菌種由斜面接入種子培養(yǎng)基，在30℃、200r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)36h，得到種子液。按1%的接種量取種子液，接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)60h。

菌懸液制備：將上述發(fā)酵液于8000r/min、4℃下離心6min獲得菌絲體，用生理鹽水洗滌2次后，加入適量生理鹽水制備16g/L的菌懸液。

1.2.2 固定化細(xì)胞的制備

海藻酸鈉-殼聚糖固定化：稱取一定量的海藻酸鈉在50℃水浴中攪拌溶解，同時(shí)稱取一定量殼聚糖用2%乙酸溶解。準(zhǔn)確將16g/L的菌懸液與等體積的海藻酸鈉溶液混合均勻，用蠕動(dòng)泵緩慢的將上述混合液滴入到4℃，0.6% CaCl2溶液中成球固化；固化結(jié)束后，將固定化細(xì)胞置于一定濃度的殼聚糖溶液中覆膜10min。經(jīng)PBS緩沖液（pH值7.0）洗滌3次置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

海藻酸鈉-明膠固定化：準(zhǔn)確將16g/L的菌懸液與等體積含有適量海藻酸鈉和明膠的固化材料溶液混合，不斷攪拌混合均勻，通過蠕動(dòng)泵恒定速度滴入到4℃，0.6% CaCl2溶液中成球固化。固化結(jié)束，以PBS緩沖液（pH=7.0）洗滌3次后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

殼聚糖-聚乙烯醇固定化：準(zhǔn)確將16g/L的菌懸液與等體積含有適量殼聚糖和聚乙烯醇的固化材料溶液混合均勻。利用蠕動(dòng)泵以恒定速度將以上混合液滴入到4℃，含有8%三聚磷酸鈉的飽和硼酸溶液中成球固化。制備結(jié)束，用PBS緩沖液（pH值7.0）洗滌3次后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的測定

從固定化細(xì)胞中挑選100顆大小均勻的固定化顆粒，連同30顆玻璃珠置于150mL三角瓶中，加水20mL，在220r/min、30℃旋轉(zhuǎn)式搖床處理48h。觀察未破碎的固定化細(xì)胞數(shù)（n）。

機(jī)械強(qiáng)度=n/100×100%

1.2.4 pH值對(duì)游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的影響

取等量的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞，在30℃， pH值分別為3、5、6、7、8、9、11條件下反應(yīng)一定時(shí)間后，分別取樣測定酶活。以最適pH值下的酶活為100%計(jì)算其他pH值下樣品的相對(duì)活力。

1.2.5 溫度對(duì)游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的影響

取等量的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞，分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，最適pH值下保溫一定時(shí)間，分別取樣測定酶活。以最適溫度下的酶活為100%計(jì)算其他溫度下樣品的相對(duì)活力。

1.2.6 游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取一定量固定化細(xì)胞分別于30℃、40℃、50℃水浴保溫，定期取樣測定固定化細(xì)胞的酶活力，考察溫浴過程酶活的變化情況。

1.2.7 酶活力的定義及測定

一個(gè)單位酶活（U）的定義：在一定條件下，每分鐘催化氰基水解產(chǎn)生1μmol/L羧酸的酶量。

酶活力測定：取適量固定化細(xì)胞置于10mL用PBS緩沖液配置的100mmol/L 3-氰基吡啶溶液中，在30℃搖床上反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束，過濾收集轉(zhuǎn)化液。

轉(zhuǎn)化液離心取上清液，稀釋后利用高效液相色譜（Agilent）在268nm下檢測，色譜柱為C18柱（Waters，4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶磷酸（0.025%）=3∶2，流速為1mL/min，柱溫30℃。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞的固定化

2.1.1 固定化細(xì)胞復(fù)合材料比例選擇

海藻酸鈉-殼聚糖固定化：海藻酸鈉固定化細(xì)胞后，再用殼聚糖溶液處理，可在其表面覆膜一層薄膜，能夠起到增強(qiáng)固定化細(xì)胞強(qiáng)度的作用，但也會(huì)影響固定化細(xì)胞對(duì)底物以及產(chǎn)物的通透性。實(shí)驗(yàn)研究了不同殼聚糖的濃度對(duì)催化活力和機(jī)械強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 殼聚糖濃度對(duì)固定化細(xì)胞酶活及機(jī)械強(qiáng)度的影響

隨著殼聚糖濃度不斷增大，固定化細(xì)胞活力逐漸降低。主要原因?yàn)闅ぞ厶菨舛仍黾雍?，在固定化?xì)胞表面形成的膜厚度和致密性也相應(yīng)增強(qiáng)，增大 了物質(zhì)進(jìn)出固定化細(xì)胞的阻力，導(dǎo)致了固定化細(xì)胞催化活力的降低。殼聚糖濃度為0.4%時(shí)，對(duì)固定化細(xì)胞活力影響小，并且機(jī)械強(qiáng)度也提高到12%。因此0.4%為殼聚糖覆膜的適宜濃度。

海藻酸鈉-明膠固定化：海藻酸鈉和明膠可以共混，然后用于菌絲體的固定化。

這種復(fù)合材料固定的方法，可通過調(diào)節(jié)凝膠濃度改善固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度和包埋率。與單一海藻酸鈉凝膠相比，在其中加入明膠后，使得凝膠的孔徑更大，更為松散，這對(duì)底物進(jìn)出固定化細(xì)胞有促進(jìn)作用[18]。如圖2所示，2.5%海藻酸鈉與2%明膠固定化細(xì)胞的活力最高，較單一海藻酸鈉固定化細(xì)胞活力提高8%左右，而且機(jī)械強(qiáng)度也有一定程度增加。

同樣，殼聚糖與聚乙烯醇也可以進(jìn)行復(fù)合固定。單獨(dú)的殼聚糖固定化凝膠網(wǎng)絡(luò)疏松，空隙較多，機(jī)械強(qiáng)度較差，而聚乙烯醇凝膠柔韌性好，機(jī)械強(qiáng)度高，網(wǎng)格致密。兩種材料復(fù)合使用，能夠起到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)作用，使得固定后的細(xì)胞既具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，也可保留較高酶活力。如圖3所示，隨著聚乙 烯醇濃度的增加，固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度不斷提高，當(dāng)添加濃度達(dá)到2%時(shí)，就可以使機(jī)械強(qiáng)度得到大幅提高。

圖2 海藻酸鈉-明膠濃度對(duì)固定化細(xì)胞強(qiáng)度和酶活的影響

圖3 殼聚糖-聚乙烯醇濃度對(duì)固定化細(xì)胞活力和強(qiáng)度的影響

2.1.2 固定化細(xì)胞制備材料的選擇

選取3種復(fù)合材料的優(yōu)化配比進(jìn)行固定化菌體，進(jìn)行底物3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，比較固定化細(xì)胞的相對(duì)活力和機(jī)械強(qiáng)度。

如表1所示，3種復(fù)合材料制備的固定化細(xì)胞均為球形。海藻酸鈉-殼聚糖復(fù)合凝膠和聚乙烯醇-殼聚糖復(fù)合凝膠的機(jī)械強(qiáng)度高于海藻酸鈉-明膠復(fù)合凝膠；聚乙烯醇-殼聚糖固定化后的相對(duì)酶活力達(dá)到85%，海藻酸鈉-明膠次之，海藻酸鈉-殼聚糖的活力僅為76%。此外，對(duì)于絲狀真菌而言，制球的工藝操作難度也是一項(xiàng)重要的衡量指標(biāo)，聚乙烯醇-殼聚糖復(fù)合凝膠制備最為簡易，其次是海藻酸鈉-明膠復(fù)合凝膠，海藻酸鈉-殼聚糖凝膠制備過程復(fù)雜，難度最大。海藻酸鈉凝膠對(duì)磷酸鹽的耐受性差，并且在中性條件下小球易裂解，不易長期保存[19]；相比之下，殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合凝膠具有較好的磷酸鹽耐受性，而且底物3-氰基吡啶能夠提高聚乙烯 醇的穩(wěn)定性，因此，從應(yīng)用角度來看，殼聚糖-聚乙烯醇是固定化G. intermedia的理想載體。

表1 不同復(fù)合材料固定化的比較

2.2 pH值對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞活力的影響

對(duì)殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化pH值進(jìn)行研究，由圖4可知，盡管固定化細(xì)胞最適反應(yīng)pH值仍為7，但固定化后對(duì)酸堿的耐受性顯著 增加。

2.3 固定化細(xì)胞最適轉(zhuǎn)化溫度

考察復(fù)合固定細(xì)胞和游離細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)化溫度，測定結(jié)果如圖5所示。

固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度為45℃，比游離細(xì)胞提高5℃，并且固定化細(xì)胞在30～50℃范圍內(nèi)酶活均達(dá)到80%以上，固定后能提高菌體對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性[11]。

2.4 固定化細(xì)胞半衰期

研究固定化菌體在不同溫度下的半衰期，考察其溫度穩(wěn)定性。圖6顯示的是固定化細(xì)胞在30℃、40℃、50℃下隨時(shí)間變化的殘留酶活力。通過計(jì)算，在上述溫度下相應(yīng)的半衰期分別為330.5h、128.3h、11.2h，比游離細(xì)胞分別提高了1.43倍、1.76倍和1.75倍[8]。這表明固定化能在一定程度上對(duì)細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用，熱穩(wěn)定性顯著提升，這也是固定化細(xì)胞可以重復(fù)多批次利用的前提。

圖4 pH值對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞酶活的影響

圖5 溫度對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞活力影響

圖6 聚乙烯醇-殼聚糖固定化細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性

2.5 固定化細(xì)胞底物濃度選擇

底物濃度是影響固定化細(xì)胞酶活力和轉(zhuǎn)化率的重要因素[21]，其中，高濃度3-氰基吡啶對(duì)細(xì)胞的毒性作用也得到了文獻(xiàn)證實(shí)，以Nocardia globerulaNHB-2腈水解酶為例，當(dāng)濃度超過300mmol/L時(shí)，即表現(xiàn)出明顯的底物抑制[22]。采用50～700mmol/L的不同初始底物濃度來考察其對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)3-氰基吡啶的濃度低于100mmol/L時(shí)，相比固定化細(xì)胞，G. intermedia游離細(xì)胞具有更高酶活力，表明固定化細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中受到了傳質(zhì)阻力的影響；不過，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?00mmol/L時(shí)，游離細(xì)胞受到底物抑制作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率不斷降低。對(duì)于固定化細(xì)胞而言，底物濃度在50～300mmol/L下，其煙酸產(chǎn)率不斷提高；底物濃度高于300mmol/L后，煙酸產(chǎn)率開始降低。該過程說明，固定化材料對(duì)細(xì)胞起到了保護(hù)作用，使其對(duì)高濃度底物的耐受性顯著提高。隨著底物濃度增加，這種優(yōu)勢(shì)能得到進(jìn)一步體現(xiàn)，傳質(zhì)阻力的影響則相應(yīng)弱化。

當(dāng)初始底物濃度達(dá)到300mmol/L時(shí)，固定化細(xì)胞能在60min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，而游離細(xì)胞需要100min，見圖8。由此可見，固定化細(xì)胞相比游離細(xì)胞底物 耐受性明顯提高，并能轉(zhuǎn)化高濃度的底物。

圖7 不同濃度底物對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞酶活力影響

圖8 不同濃度底物轉(zhuǎn)化過程曲線

2.6 固定化細(xì)胞重復(fù)批次實(shí)驗(yàn)

利用固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化，研究固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的操作穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)化過程在最適條件下進(jìn)行，底物濃度為300mmol/L。每一批次反應(yīng)結(jié)束后，催化劑經(jīng)過洗滌后轉(zhuǎn)入新的轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行下一批次轉(zhuǎn)化。如圖9所示，游離細(xì)胞可重復(fù)利用9次，每克干細(xì)胞能轉(zhuǎn)化生產(chǎn)93.9g煙酸；固定化細(xì)胞則能重復(fù)利用26次，每克干細(xì)胞可生產(chǎn)283.5g煙酸。固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力是游離細(xì)胞的3倍，其細(xì)胞利用率顯著增加。

2.7 固定化細(xì)胞的補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化

對(duì)固定化細(xì)胞分批補(bǔ)料連續(xù)轉(zhuǎn)化模式進(jìn)行研究，以考察其對(duì)于連續(xù)轉(zhuǎn)化操作的適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)過程中，每隔1h向反應(yīng)體系中添加300mmol/L 3-氰基吡啶并且取樣檢測轉(zhuǎn)化情況，見圖10。

分批補(bǔ)料12次，固定化細(xì)胞均能將底物完全轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化能力相當(dāng)于每克干細(xì)胞產(chǎn)生132.6g煙酸。當(dāng)超過12次后，由于底物抑制作用轉(zhuǎn)化能力開始下降，反應(yīng)體系中底物3-氰基吡啶出現(xiàn)積累。當(dāng)補(bǔ)料至第19次時(shí)，固定化細(xì)胞相對(duì)酶活只有約30%，轉(zhuǎn)化能力大幅度下降。以19批次進(jìn)行計(jì)算，則每克 干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力達(dá)到191.3g煙酸。

圖9 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的重復(fù)利用性能

圖10 固定化細(xì)胞補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化

3 結(jié) 論

利用復(fù)合固定化技術(shù)對(duì)G. intermediaCA3-1游離細(xì)胞進(jìn)行固定化和轉(zhuǎn)化條件研究，以固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活和機(jī)械強(qiáng)度作為綜合考察因素，選擇出聚乙烯醇-殼聚糖為理想的復(fù)合包埋材料。采用這種方式的固定化細(xì)胞，其熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均比游離細(xì)胞有明顯改善，并對(duì)高濃度底物的耐受性顯著增強(qiáng)，單位細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力大幅提高。菌體固定化后，其利用效率得到改善，可用于連續(xù)循環(huán)轉(zhuǎn)化，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度，便于產(chǎn)品的后續(xù)分離，使生物法制備煙酸更為經(jīng)濟(jì)。

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