維藥阿育魏實(shí)總黃酮抗氧化活性研究

張 慧，章立華，黃 瓊，熱娜·卡斯木

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

維藥阿育魏實(shí)總黃酮抗氧化活性研究

張 慧，章立華，黃 瓊，熱娜·卡斯木*

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

[目的]評價(jià)阿育魏實(shí)總黃酮的抗氧化能力。[方法]采用羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基體系對阿育魏實(shí)總黃酮抗氧化的能力進(jìn)行研究。 [結(jié)果]在質(zhì)量濃度0.025～0.500 mg/ml的范圍內(nèi)，阿育魏實(shí)總黃酮對羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率分別為31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且存在明顯的量效關(guān)系。IC50分別為 0.038 49、0.053 51、0.271 60、0.026 17和0.033 87 mg/ml。[結(jié)論]阿育魏實(shí)總黃酮具有很好的體外抗氧化活性，是一種新型天然抗氧化物質(zhì)來源。

阿育魏實(shí)；總黃酮；自由基；抗氧化活性

阿育魏實(shí)為傘形科糙果芹屬[Trachyspermumammi(L.)Sparμge]植物的干燥成熟果實(shí)。全世界糙果芹屬植物有12種，分布于非洲至南亞，我國有2種即糙果芹和馬爾康糙果芹(T.triadiatumWoLff)及1個(gè)變種[T.scaberuLum(Franch.)WoLff.ex hand-Mazz.var.ambrosii- foLium(Franch)]又稱阿米糙果芹[1]。新疆和田、喀什地區(qū)普遍栽培[2]，具有驅(qū)風(fēng)散寒，健胃消食，用于食欲不振、胃寒作痛、小便不利、尿路結(jié)石、偏癱及皮膚病等。阿育魏實(shí)所含麝香草酚，對口腔、咽喉粘膜有殺細(xì)菌和真菌的作用，對齲齒有防腐和局麻作用[3]，還用于皮膚化膿性感染及真菌和放線菌病，其醇提物(10%)對葡萄球菌、大腸桿菌有抑制作用，其稀釋液可作祛痰劑[4]。阿育魏實(shí)用于很多維吾爾藥的復(fù)方制劑中，是常用的藥材品種，收載于中華人民共和國藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊[5]。在印度等地阿育魏實(shí)被用作香料，也作為糕點(diǎn)和飲料添加劑和防腐劑[6]。

為了進(jìn)一步開發(fā)利用阿育魏實(shí)資源，筆者以阿育魏實(shí)總黃酮為研究對象，采用羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基體系對阿育魏實(shí)總黃酮抗氧化的能力進(jìn)行研究，以期為阿育魏實(shí)總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。阿育魏實(shí)種子，購自自治區(qū)維吾爾醫(yī)院、喀什地區(qū)維吾爾醫(yī)院、和田地區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為傘形科糙果芹屬[Trachyspermumammi(L.)Sparμge]的成熟果實(shí)。

1.1.2 主要儀器。UV-2550型分光光度計(jì)，購自日本島津公司；SK2510HP超聲波清洗儀，購自上?？茖?dǎo)超聲清洗儀有限公司；XS105型十萬分之一電子天平，購自瑞士梅特勒-托利多公司。

1.1.3 主要試劑。蘆丁對照品，購自中國藥品生物制品檢定所；OH試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基自由基，購自DPPH.sigma公司；ABTS，購自sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺，均購自上海緣聚生物科技有限公司；濃鹽酸、無水乙醇、三氯化鋁均為分析純，市售；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 阿育魏實(shí)黃酮工作液的制備。精密稱取阿育魏實(shí)樣品：自治區(qū)維吾爾醫(yī)院1.000 6 g，喀什地區(qū)維吾爾醫(yī)院1.000 4 g，田地區(qū)維吾爾醫(yī)院1.000 2 g，分別置于索氏提取器中，用石油醚加熱回流30 min，棄去提取液，揮干殘?jiān)缓蠹尤霛舛?0%乙醇50 ml超聲2次，每次30 min，過濾，用濃度60%的乙醇定容至100 ml，搖勻備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]。精密稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁對照品10.00 mg，用濃度60%的乙醇溶解，定容為100 ml，即配置成濃度為100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 ml分別置于10 ml容量瓶中，加入濃度5%的三氯化鋁溶液3 ml，pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 ml，最后用濃度60%的乙醇定容，搖勻，即配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。熒光測定條件優(yōu)化為：激發(fā)波長429.0 nm，發(fā)射波長529.0 nm，激發(fā)光譜通帶10.0 nm，發(fā)射光譜通帶5.0 nm，測定溶液的pH=6的條件下繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 阿育魏實(shí)總黃酮含量測定。精密量取樣品溶液0.5 ml至10 ml容量瓶中，加入濃度5%的三氯化鋁3 ml，pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 ml，最后用濃度60%的乙醇定容至10 ml 。按“1.2.2”項(xiàng)下條件操作。

1.2.5 對·OH的清除能力[8-9]。參照Fenton反應(yīng)法建立·OH自由基體系模型：H2O2與Fe2+混合后產(chǎn)生·OH的Fenton反應(yīng)為:H2O2+Fe2+=OH-+·OH + Fe3+，試驗(yàn)操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH試劑盒說明書進(jìn)行。在反應(yīng)體系中分別加入樣品溶液0.2 ml，檢測體系中的·OH的剩余量。按下式計(jì)算阿育魏實(shí)總黃酮對·OH的清除率：·OH清除率(%)=(對照管OD-測定管OD)/ 對照管OD×100。

1.2.7 對DPPH自由基的清除能力[11]。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，由于DPPH自由基有一個(gè)單電子并在517 nm處有強(qiáng)的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物質(zhì)提供一個(gè)電子使此單電子配對，其吸收將會(huì)消失，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系。測定步驟為：取2 ml的樣品溶液于5 ml容量瓶中，加入2 ml濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液混合均勻，密閉靜止30 min后，在517 nm處測定其吸光度Ai，2 ml的0.1 mg/ml樣品與2 ml醇溶液測定吸光度為Aj，2 ml DPPH溶液與2 ml 2次蒸餾水的吸光度Ao。按下式計(jì)算阿育魏實(shí)總黃酮對DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。式中：Ao為未加抗氧化劑時(shí)DPPH溶液的吸光度；Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度；Aj為抗氧化劑在測定波長的吸光度。

1.2.8 ABTS自由基的清除能力[11]。取7 mol/L的ABTS和140 mmol/L的過硫酸鉀溶液分別取5 ml和88 μl，在室溫避光條件下靜置過夜，配置ABTS自由基儲(chǔ)備液，然后按照1∶50的比例用蒸餾水稀釋成工作液。樣品管中加入200 μl的樣品溶液和3 ml的ABTS工作液，空白管用2次蒸餾水代替樣品溶液，對照管用2次蒸餾水代替ABTS溶液，在室溫條件下避光放置1 h，于730 nm處測定吸光度。按下式計(jì)算阿育魏實(shí)總黃酮對ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿育魏實(shí)總黃酮含量的測定 計(jì)算得蘆丁回歸方程問：Y=19.156X-0.090 5，R=0.999 8。試驗(yàn)結(jié)果表明，在4～24 μg/ml范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。按回歸方程計(jì)算阿育魏實(shí)總黃酮含量，和田地區(qū)總黃酮含量最高，為(14.06±0.26)mg/g；其次為喀什地區(qū)，含量為(13.72±0.21)mg/g；最小的為自治區(qū)維醫(yī)院 ，含量為(13.24±0.23)mg/g(表 1)。

表1 阿育魏實(shí)總黃酮含量測定結(jié)果

2.2 阿育魏實(shí)不同濃度總黃酮清除各自由基的能力 圖 1表明，阿育魏實(shí)總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基都有一定的清除作用，在質(zhì)量濃度0.025～0.5 mg/ml的范圍內(nèi)，其清除各自由基的能力分別為31.68%～99.01%、27.45%～90.52%、11.62%～86.40%、41.31%～92.21%和17.53%～62.67%，且隨著濃度的增加，其對上述各自由基的清除能力增強(qiáng)，即兩者之間存在量效關(guān)系。阿育魏實(shí)總黃酮濃度對各自由基清除率的變化曲線，對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基以質(zhì)量濃度的對數(shù)對清除率進(jìn)行線性回歸，計(jì)算IC50分別為0.038 49、0.053 51和0.271 60 mg/ml，對亞硝基自由基、ABTS自由基以質(zhì)量濃度對清除率進(jìn)行線性回歸，計(jì)算IC50分別為0.026 17和0.033 87 mg/ml。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿育魏實(shí)總黃酮對各自由基的清除能力有差別，IC50越低，清除自由基的能力越強(qiáng)，阿育魏實(shí)總黃酮對上述自由基的清除能力為：清除DPPH·能力最強(qiáng)，高于ABTS·，羥基自由基，超氧陰離子自由基，對亞硝基自由基的清除能力最低。所以可以選擇性使用阿育魏實(shí)總黃酮清除不同的自由基。

2.3 不同地區(qū)阿育魏實(shí)總黃酮清除自由基能力的比較 取

圖1 阿育魏實(shí)不同濃度總黃酮清除各自由基的能力

不同地區(qū)的阿育魏實(shí)總黃酮樣品，配制相同濃度的維生素C溶液作陽性對照，計(jì)算清除率。圖 2表明，不同地區(qū)阿育魏實(shí)總黃酮清除各自由基的能力有差別，其能力的差別與不同地區(qū)阿育魏實(shí)所含的總黃酮含量成正比，3個(gè)地區(qū)阿育魏實(shí)總黃酮含量為：和田地區(qū)14.06 mg/g，喀什地區(qū)13.72 mg/g，自治區(qū)維醫(yī)院13.24 mg/g。與維生素C相比，除羥基自由基外，維生素C對各自由基的清除能力在0.1 mg/ml時(shí)，多高于阿育魏實(shí)總黃酮。

圖2 不同地區(qū)阿育魏實(shí)總黃酮清除自由基的能力

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過阿育魏實(shí)總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除作用試驗(yàn)表明，阿育魏實(shí)總黃酮能有效清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、亞硝基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基，其中清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，且對各自由基的清除能力與用量成正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明,阿育魏實(shí)總黃酮含量豐富。其總黃酮的抗氧化活性的研究顯示，阿育魏實(shí)總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，提示阿育魏實(shí)總黃酮極有可能是一種天然抗氧化劑的新資源，值得進(jìn)一步深入研究。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志.第五十五卷，第二分冊[M].北京:科學(xué)出版社，1997:13-15.

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[4] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.上冊[K].上海:上海人民出版社，1977:1189.

[5] 中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：42.

[6] 馬慶東，李國玉，王金輝.維吾爾藥阿育魏實(shí)藥理活性研究進(jìn)展[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué)，2011，33(2)：180-184.

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[11] 邱金東，湯昆． DPPH 和 ABTS 法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J]． 中成藥，2008，30(8):1215-1216．

Study on Antioxidant Activity of Total Flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge

ZHANG Hui, RENA·Kasim et al

(Pharmacy College of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011)

[Objective] To evaluate antioxidant capacity of total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge. [Methods] Using hydroxyl free radicals, superoxide anion free radicals, nitroso free radicals, DPPH free radicals, and ABTS free radical system on total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge. [Results] In the mass concentration within the range of 0.025-0.5 mg/ml, its ability to remove the free radicals was 31.68%-99.01%, 27.45%-90.52%, 11.62%-86.40%, 41.31%-92.21%, and 17.53%-62.67%, and there was significant dose-response relationship.IC50was 0.038 49 mg/ml, 0.03849 mg/ml, 0.03849 mg/ml, 0.053 51 mg/ml, and 0.033 87 mg/ml respectively. [Conclusion] Total flavonoids ofTrachyspermumammi(L.) Sparuge has high antioxidant activity in vitro and is a new kind of natural antioxidant.

Trachyspermumammi(L.) Sparuge; Total flavonoids; Free radical; Antioxidant activity

新疆醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新基金(XJC2011117)。

張慧(1964-)，女，安徽亳州人，副教授，從事天然藥物研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，博士，從事天然藥物研究。

2014-05-04

S 567

A

0517-6611(2014)15-04624-02