草莓花枯病原真菌的PCR檢測

王振華+張建坤+徐家文+龔國祥+曾憲東+鄭劍++邱國強+

摘要：為了建立簡易、快速的草莓花枯病原真菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）的ＰＣＲ檢測技術(shù)，以從美國ＡＴＣＣ購買的標準菌株１４６９１ＴＭ為試驗材料，通過真菌的通用引物對ＩＴＳ４和ＩＴＳ５的ＰＣＲ擴增，從受感染草莓的根、葉、花、果實４個部位分離的菌株擴增到長度為６７０ ｂｐ的特異性條帶，ＤＮＡ測序證實了這一擴增產(chǎn)物與ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ內(nèi)草莓花枯病原真菌的相關(guān)序列有高度序列同源性。結(jié)合草莓根、葉、花、果實的接種及分離、病原菌形態(tài)觀察及致病性鑒定等結(jié)果，確定通用引物ＰＣＲ擴增技術(shù)可以作為草莓花枯病菌檢測的基本方法。

關(guān)鍵詞：草莓花枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）；植物檢疫；ＰＣＲ

中圖分類號：Ｓ４１１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2052-03

PCR Detection of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen

WANG Zhen-hua1,ZHANG Jian-kun2,XU Jia-wen1,GONG Guo-xiang1,ZENG Xian-dong1,

ZHENG Jian1,QIU Guo-qiang1

Ａｂｓｔｒａｃｔ： A standard isolate 14691TM from ATTC (U.S.A.) was used to explore an easy and quick PCR detection of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen. PCR amplifications focusing on ITS4 and ITS5 regions by universal fungal primers were done, DNA bands of 670 bp were obtained from root, leaf, blossom and fruit isolates of infected hosts. Results of DNA sequencing showed that the amplified products had high homogeneity with the related sequence in GenBank, NCBI. According to the results of pathogen inoculation and isolation of root, leaf, blossom and fruit, morphological observation and pathogenicity analysis, the universal primer-PCR was a basic method to detect Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ； ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ； ＰＣＲ

草莓花枯病原真菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｆｒａｇａｒｉａｅ）是世界范圍內(nèi)廣泛分布的一種嚴重危害草莓產(chǎn)業(yè)的病原菌，被列為我國對外公布的檢疫性有害生物，目前在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)。本研究從美國ＡＴＣＣ購買標準菌株１４６９１ＴＭ，試圖開發(fā)一種特異引物的ＰＣＲ檢測方法，現(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

標準菌株１４６９１ＴＭ［１］（美國ＡＴＣＣ），用于接種、致病性分析的草莓植株品種為晶玉。

１．２特征觀察

２０１３年３月將標準菌株１４６９１ＴＭ接種于健康草莓苗，７ ｄ后開始觀察草莓的根、葉、花、果實和整個植株的癥狀。

１．３直接鏡檢

將有明顯病癥的根系、花蕾和果實材料置于體視顯微鏡下檢查，直接挑取病部子實體制成玻片，置于生物顯微鏡下鏡檢，觀察記錄菌絲、擔子果、擔子的形態(tài)特征和著生方式，并測量其大小。

１．４保濕培養(yǎng)

當根系、花蕾或果實上只有可疑病狀而無明顯病癥時，將病根（截成５ ｃｍ）或繁殖材料置于樣品袋中，于２０～２５ ℃下保濕培養(yǎng)，每天觀察癥狀的變化，并進行顯微鏡檢和分離培養(yǎng)。

１．５分離培養(yǎng)

取具有疑似發(fā)病癥狀的根、花冠或葉柄，用自來水沖洗并用吸水紙吸干表面水分。用１％ＮａＣｌＯ表面消毒１～２ ｍｉｎ，用無菌水沖洗２次，用無菌吸水紙吸干表面水分后，放入瓊脂平板（含２５０ μｇ／ｍＬ的氯霉素）表面，當組織表面長出菌絲后，將菌絲轉(zhuǎn)移至ＰＤＡ平板（含２５０ μｇ／ｍＬ的氯霉素）上，繼續(xù)培養(yǎng)２～３ ｄ。小心挑取新長出的菌絲，轉(zhuǎn)接到新的ＰＤＡ平板上進行真菌的純化培養(yǎng)。連續(xù)轉(zhuǎn)接２次，獲得真菌的純培養(yǎng)物。

１．６菌絲和核的形態(tài)觀察

將真菌純培養(yǎng)物接種在含有１ ｍｍ厚的ＰＤＡ平板上，培養(yǎng)３～５ ｄ，在菌絲生長最旺盛的邊緣取出帶有菌絲的瓊脂碟片，在３．５％的甲醛中固定，用無菌水沖洗，然后在二氨基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ）染色４ ｍｉｎ，再用無菌水退色３ ｍｉｎ。在顯微鏡紫外光下觀察菌絲的形態(tài)及核的數(shù)量。

１．７ＰＣＲ檢測

取菌絲樣品１ ｇ，液氮研磨后取樣０．１～０．２ｇ，采用ＣＴＡＢ提取法提取樣品總ＤＮＡ［２］，應(yīng)用真菌通用引物對ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）、ＩＴＳ５（５′－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３′）［３］和ｒＤＮＡ－ＩＴＳ片段（核糖體ＩＴＳ１、ＩＴＳ２和５．８Ｓ基因）進行ＰＣＲ擴增。

ＰＣＲ反應(yīng)總體積為２５ μＬ，含有５０ ｍＭ ＫＣｌ、２０ ｍmol/LＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、２ ｍmol/L ＭｇＣｌ２、２００ μmol/L ｄＮＴＰｓ、０．２ μmol/L同源引物和互補引物、２ Ｕ Ｔａｑ酶和１ μＬ ＤＮＡ模板。

ＰＣＲ反應(yīng)程序：９５ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９５ ℃變性３０ ｓ， ５０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，共３６個循環(huán)；７２ ℃補時延伸５ ｍｉｎ。

擴增產(chǎn)物在１．２％的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈下觀察擴增結(jié)果。６７０ ｂｐ ＤＮＡ片段經(jīng)純化后測序，應(yīng)用ＢＬＡＳＴ與ＧｅｎＢａｎｋ內(nèi)同源序列進行比對分析。

２結(jié)果與分析

２．１感染草莓花枯病原真菌的草莓植株特征

２．１．１根系癥狀感染病原真菌的草莓根系癥狀最為明顯。整個根系比健康植株的明顯小，側(cè)根數(shù)量減少，白色肉質(zhì)根上分布有不規(guī)則的黑色塊狀，根內(nèi)為黃色到白色。嚴重感染時，這些黑色區(qū)域連成片，使整個白色肉質(zhì)根變黑。感染的木質(zhì)根初期外部變?yōu)楹谏?，后來根?nèi)也完全變黑，橫切木質(zhì)根時可見根內(nèi)完全變黑，主根全部或部分（特別是根尖部分）死亡。

２．１．２花癥狀病原真菌主要侵染花蕾?；ǔ蹰_時，花藥暗褐色，雌蕊區(qū)域光滑，雌蕊缺失。侵染發(fā)生在花冠出現(xiàn)之前或者之后的短時間內(nèi)，在花蕾開放后很快結(jié)束。被嚴重侵染的花，在開花前花藥和雌蕊都被破壞，當花蕾隆起花瓣可見時，花瓣外可見褐色的損傷，花瓣區(qū)域初期呈粉紅色，后顏色逐漸變深為黑色，花心變黑，類似于凍害癥狀。

２．１．３果實癥狀侵染初期發(fā)病果實病部變褐，變硬。成熟果實變軟，表面有白色稀疏菌絲體。果實表現(xiàn)不同程度的畸形。

２．１．４植株癥狀植株長勢較差、矮化，產(chǎn)果小且少。葉片面積變小，單片或多片葉可能萎蔫、退色甚至死亡。嚴重時，整個植株死亡。

２．２形態(tài)觀察

在隨機選取的根、花和果實的分離物中，在顯微鏡下均觀察到了典型的草莓花枯病原真菌的形態(tài)特征。菌絲細胞有雙核，菌絲初無色，寬３～９ μｍ，無鎖狀連接，老熟后呈褐色，在分支處縊縮。在培養(yǎng)基上，很少產(chǎn)生菌核，菌核表面粗糙，褐色至黑色，表里顏色相同，菌核之間有絲狀體相連，不產(chǎn)生無性孢子，可產(chǎn)生大量的念珠形孢子鏈。擔子果（子實體）平展、薄、白色。擔子為橢球狀至近似棒狀，（９～１４）μｍ×（８～１２）μｍ，有４個孢子梗。擔孢子為橢球狀和近似紡錘狀，（６～１１）μｍ×（４～６）μｍ。因此，可初步判定這些樣品攜帶了該病原真菌。

２．３致病性測試

草莓種子在３％的ＮａＣｌＯ溶液表面消毒１ ｈ，并在無菌水中浸泡過夜，播種于無菌的含土填充物的塑料缽中，用塑料布封蓋，置于連續(xù)光照下，待幼苗長出２片真葉時進行病原真菌的接種試驗。陽性的致病性分離物在ＰＤＡ平板（含２５０ μｇ／ｍＬ氯霉素）上培養(yǎng)２ ｄ，用打孔器在菌絲生長最旺盛的邊緣各取若干個直徑為２ ｍｍ的帶有菌絲的瓊脂碟片，挫傷接種葉片，置于１５～２０ ℃下光照培養(yǎng)，５～８ ｄ后接種點周圍出現(xiàn)淺褐色枯死斑，符合草莓花枯病原真菌引發(fā)的典型病理學特征。試驗還發(fā)現(xiàn)，對發(fā)病花或根再做病原菌分離，該分離物仍可以觀察到與草莓花枯病原真菌一致的形態(tài)特征。

２．４ＰＣＲ檢測

從感病的葉、花、果實和根部分離的真菌菌絲樣品提取總ＤＮＡ，ＰＣＲ擴增后產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，所有擴增到的條帶都清晰、明亮、大小約６７０ ｂｐ的片段，不見明顯的非特異性雜帶（圖１），符合預(yù)期的擴增結(jié)果。純化的ＤＮＡ片段的ＤＮＡ測序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ內(nèi)草莓花枯病原真菌的相關(guān)序列有高度的同源性（９９％），證實了ＰＣＲ擴增的結(jié)果。

３小結(jié)與討論

草莓花枯病原真菌主要分布于北美洲、歐洲、亞洲，如美國、日本、法國、意大利、巴西等，而在中國目前尚未發(fā)現(xiàn)［４－６］。研究表明，它可以通過感病的植株、病殘體以及受侵染的種子等植物性材料的遠距離運輸造成人為的傳播［５－７］。我國是草莓種植大國，存在大量的感病寄主，氣候和農(nóng)業(yè)條件都適合草莓花枯病菌的生長，一旦該病原菌傳入我國將對我國的草莓產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。因此，加強口岸檢疫措施是防范該病原真菌傳入我國的有效途徑。

本研究以草莓花枯病原真菌標準菌株１４６９１ＴＭ為出發(fā)菌株，建立了以擴增ｒＤＮＡ中ＩＴＳ區(qū)域為目標的ＰＣＲ檢測體系，其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的生物檢測、 鑒定結(jié)果一致［６，７］。因此，本研究開發(fā)的ＰＣＲ檢測技術(shù)可以成為草莓花枯病原真菌的常規(guī)檢測方法，滿足口岸檢疫的簡易、快速的要求。

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