利用青海大黃油菜與黑芥人工合成芥菜型油菜

趙志剛

摘要：以蕓薹屬植物青海大黃油菜（Brassica rape）和黑芥（Brassica nigra）為研究對(duì)象，對(duì)其常規(guī)雜交后，通過離體胚培養(yǎng)獲得的雜種種子經(jīng)MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)成苗，獲得了青海大黃油菜與黑芥的雜種F1代植株，形態(tài)上表現(xiàn)為中間類型。通過細(xì)胞學(xué)的方法，鑒定了雜種F1代植株的細(xì)胞染色體數(shù)為18條，為母本青海大黃油菜（2n=AA=20）和父本黑芥（2n=BB=16）的配子染色體數(shù)之和；SSR分子鑒定進(jìn)一步表明，該雜種植株為真雜種。

關(guān)鍵詞：青海大黃油菜（Brassica rape）；黑芥（Brassica nigra）；種間雜交；胚培養(yǎng)；芥菜型油菜

中圖分類號(hào)：X565.4；S334.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1746-04

New Brassica juncea Sythesized from Interspecific Hybridization Between B. rapa（Qinghai dahuang） and B. nigra

ZHAO Zhi-Gang

（Academy of Agriculture and Forestry， Qinghai University/National Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm/Key Laboratory of Spring Rape Genetic Improvemen of Qinghai Province， Xining 810016， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｎｅｗ Ｂｒａｓｓｉｃ ｊｕｎｃｅａ ｃａｎ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂ． ｒａｐａ×Ｂ． ｎｉｇｒａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｓｈｏｏｔ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｏｆ Ｆ１ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ １８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｓｕｍ ｏｆ ｇａｍｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（２ｎ＝ＡＡ＝２０） ａｎｄ ｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｎｉｇｒａ（２ｎ＝ＢＢ＝１６）． ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｕｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ（Ｑｉｎｇｈａｉ ｄａｈｕａｎｇ）ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ． Ｔｈｅ rｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｎｇｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉａｃ ｊｕｎｃｅａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉｎｇｈａｉ Ｄａｈｕａｎｇ ｒａｐｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐｅ）； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ； ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ； ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ

蕓薹屬植物由白菜（Brassica pekinensis， 2n=AA=20）、甘藍(lán)（B. oleracea，2n=CC=18）、黑芥（B. nigra， 2n=BB=16）3個(gè)基本種和甘藍(lán)型油菜（B. napus，2n=AACC=38）、埃塞俄比亞芥（B. carinata，2n=BBCC=34）、芥菜型油菜（B. juncea，2n=AABB=36）3個(gè)復(fù)合種組成，是一個(gè)遺傳類型極其豐富、變異極其廣泛的基因庫，這為蕓薹屬植物的種間雜交或與近緣屬的屬間雜交以及培育或創(chuàng)造作物新品種、新類型提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)及遺傳背景。近年來，人們對(duì)屬內(nèi)各個(gè)種進(jìn)行了遺傳、育種、栽培等方面的研究，為各個(gè)種的綜合利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，進(jìn)行了大量的種間雜交、屬間雜交，探討了種屬間關(guān)系，創(chuàng)造出大量的遺傳育種新材料，推動(dòng)了油菜遺傳育種的研究。李再云等［1，2］、徐利遠(yuǎn)等［3］研究了甘藍(lán)型油菜與諸葛菜、藍(lán)花子間的遠(yuǎn)緣雜交，以及諸葛菜、藍(lán)花子與蕓薹屬的親緣關(guān)系和雜種后代的細(xì)胞學(xué)行為。文雁成等［4］、張國慶等［5］利用甘藍(lán)與白菜雜交，進(jìn)行了人工合成甘藍(lán)型油菜的研究，拓寬了甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)。Chen等［6］利用甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜品種，Poulsen等［7］利用埃塞俄比亞芥和甘藍(lán)型油菜品種，Meng等［8］利用白菜和埃塞俄比亞芥與甘藍(lán)型油菜品種進(jìn)行種間遠(yuǎn)緣雜交，將不同優(yōu)良性狀導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜中，創(chuàng)造了大量遺傳育種的中間材料。

青海大黃油菜是青海農(nóng)家白菜型油菜品種，近年來育種工作者在育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)大黃油菜粒大、種皮鮮黃、能自交結(jié)實(shí)，表現(xiàn)出一系列的優(yōu)良性狀，但國內(nèi)外目前還未對(duì)該品種資源的優(yōu)良特性進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，也鮮見將該資源應(yīng)用于油菜育種中。因此，利用青海大黃油菜與黑芥種間有性雜交，將青海大黃油菜的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)入到芥菜型油菜中，再以新型的芥菜型油菜去轉(zhuǎn)育現(xiàn)有的芥菜型油菜品系，可以獲得自然界沒有的芥菜型油菜新資源。然而，不同種、屬或親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的個(gè)體間的遠(yuǎn)緣雜交存在雜交不親和性和雜種后代生活力弱等缺點(diǎn)。在十字花科植物中， 青海大黃油菜和黑芥屬于不同種的植物， 二者存在嚴(yán)重的雜交不親和性，胚挽救和子房培養(yǎng)等技術(shù)能夠用來克服雜交不親和性， 提高雜交效率。因此，本試驗(yàn)通過青海大黃油菜與黑芥的雜交，適時(shí)摘取正在發(fā)育的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，獲得了青海大黃油菜與黑芥的雜交F1代幼苗，并對(duì)幼苗進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記的鑒定。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為青海大黃油菜和黑芥。上述材料均由青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供，并于2012年4月種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院四號(hào)試驗(yàn)基地。

1.2方法

1.2.1種間有性雜交2012年6月，選取生長健壯的青海大黃油菜為母本，摘除已開花的花蕾和過小的花蕾，對(duì)尚需2~3 d后才能開花的花蕾進(jìn)行剝蕾去雄，授以黑芥的新鮮花粉，每次授粉完成后立即套袋。

1.2.2胚搶救、快繁及染色體加倍試驗(yàn)以青海大黃油菜×黑芥組合為研究對(duì)象，從雜交后10 d開始解剖、觀察胚的發(fā)育情況以確定最適培養(yǎng)時(shí)間。雜交后18~22 d，將取回的子房先用70%的乙醇處理2 min，再用0.1%的氯化汞消毒處理15 min后，用無菌水洗3次，每次5 min，在超凈工作臺(tái)上，用消毒的鑷子在無菌濾紙上小心將幼胚剝出，放在含有3%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在25 ℃的光照培養(yǎng)室培養(yǎng)直到分化成苗，成苗后將無菌苗轉(zhuǎn)到含有0.25 mg/L NAA（a-萘乙酸）、1.5 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行快速繁殖。15~20 d后，幼苗轉(zhuǎn)入含0.1 mg/L NAA的MS生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。將幼苗移栽溫室30 d后，再將部分苗子挖出，用100 mg/L的秋水仙素溶液浸泡幼苗的根部3~4 h，后用清水連續(xù)沖洗5~6次，再次栽于溫室中。試驗(yàn)中所用各培養(yǎng)基成分具體見表1。

1.2.3真假雜種鑒定試驗(yàn)

1）F1代植株形態(tài)學(xué)觀察。2013年3~5月，觀察、記載F1代雜種植株生長發(fā)育不同階段的形態(tài)變化，并照相。

2）普通細(xì)胞學(xué)鑒定。用0.002 mol/L的8-羥基喹啉處理F1植株幼小花蕾中的子房，3 h后用卡諾固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定24 h后，室溫保存。取固定好的子房用1 mol/L的HCI在60 ℃恒溫水浴鍋中水解5~8 min，用10%改良卡寶品紅染色并壓片，在顯微鏡下觀察并記錄染色體數(shù)目。

3）雜種后代的分子鑒定。采用CTAB小樣法提取油菜基因組DNA，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行真假雜種鑒定，其PCR反應(yīng)體系為：10×buffer（含Mg2+）1.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.80 μL，5U Taq酶0.15 μL，50 ng/μL引物各0.25 μL，50 ng/μL DNA 1.00 μL，ddH2O 6.55 μL。其中Taq酶和dNTPs均購自大連寶生物有限公司， SSR引物由上海生工合成，本研究所用引物名稱及序列見表2。

2結(jié)果與分析

2.1遠(yuǎn)緣雜種的獲得

2011年以青海大黃油菜為母本、黑芥為父本進(jìn)行雜交授粉，授粉后30 d左右取回莢果，剝離胚珠，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胚在發(fā)育過程中夭亡，莢果內(nèi)只剩下種皮，沒有獲得遠(yuǎn)緣雜交的種子。2012年從授粉后10 d開始解剖觀察胚的發(fā)育情況，以此確定最適胚搶救時(shí)間。結(jié)果表明，授粉26 d后部分胚珠珠被開始皺縮變白，在以后的幾天里胚珠逐漸變褐發(fā)黑，胚乳已經(jīng)敗育，胚珠逐漸死亡，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。綜合以上調(diào)查結(jié)果，對(duì)所有雜交組合在雜交授粉后22 d取材進(jìn)行胚培養(yǎng)是最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.2雜種形態(tài)學(xué)觀察與性狀分析

雜種苗分為2批種植于溫室，其中一批經(jīng)過秋水仙素進(jìn)行染色體加倍，一批未加倍。未經(jīng)過加倍的雜種苗生長旺盛，葉子的顏色和形狀介于青海大黃油菜與黑芥之間，葉面上生有小刺毛，特別是葉子邊緣上的剛毛比較明顯，這一點(diǎn)與父本黑芥相同，葉邊緣鋸齒狀較淺，介于父本和母本之間（圖1）。從成熟植株的形態(tài)看， 雜種植株分枝較多， 分枝部位較低。在現(xiàn)蕾期和開花期，雜種植株的花藥全部退化。

2.3染色體加倍效果

用秋水仙素處理20株雜種幼苗根部以進(jìn)行染色體加倍，結(jié)果顯示秋水仙素對(duì)其有明顯的毒害作用，部分植株莖尖縮短，部分植株基部潰爛、死亡，只有9株能正常生長，開始長勢(shì)良好，但1個(gè)月后，9株正常生長的幼苗依次從基部的葉片開始變黃，直至全部死亡。本研究沒有獲得染色體加倍成功的人工芥菜型油菜，在沒有進(jìn)行加倍處理的植株中也未發(fā)現(xiàn)自然加倍植株。

2.4雜種后代的細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

青海大黃油菜的體細(xì)胞染色體數(shù)為20條，父本黑芥的體細(xì)胞染色體數(shù)為16條。對(duì)雜交后胚培養(yǎng)獲得的F1代幼小子房進(jìn)行了體細(xì)胞觀察，發(fā)現(xiàn)雜種體細(xì)胞具有18條染色體（圖2），為青海大黃油菜（n=10）和黑芥（n=8）配子染色體數(shù)目之和， 在細(xì)胞學(xué)水平上進(jìn)一步說明了F1代植株是真雜種。

2.5雜種后代的SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

取親本和F1植株的幼嫩葉片提取DNA，進(jìn)行SSR分子標(biāo)記鑒定，10對(duì)引物中引物SSR549和SSR646在親本青海大黃油菜和黑芥中分別檢測(cè)到特異性條帶，因此這兩對(duì)引物可用于種間雜種F1植株的鑒定。對(duì)所獲得的7株F1雜種植株SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，由青海大黃油菜與黑芥雜交得到的F1雜種植株同時(shí)具有父、母本的特征帶（圖3），為真雜種。

3討論

3.1子房培養(yǎng)與胚培養(yǎng)的有效性

由于青海大黃油菜和黑芥的種間雜交不親和性，大田條件下很難收獲到它們的種間雜種。在本次試驗(yàn)中，所有的正交組合（青海大黃油菜×黑芥）和反交組合中（黑芥×青海大黃油菜）都通過胚搶救來獲得雜種，但是，僅在正交組合中獲得了雜種，反交組合均未成功獲得雜種。Watkins［9］認(rèn)為不同染色體數(shù)目的種間雜交時(shí)采用染色體數(shù)目高的作母本較易成功。Müntzing［10］也曾提出一個(gè)假說， 種子各部分的染色體數(shù)必須是母本組織∶胚乳∶胚=2∶3∶2，如果這一比例因倍數(shù)不同的種間雜交而擾亂就會(huì)發(fā)生敗育情形，本研究的結(jié)果與這些假設(shè)基本一致。同時(shí)，Inomata［11］的研究表明，子房培養(yǎng)能大大提高白菜×甘藍(lán)組合的雜種獲得率，而對(duì)于反交組合甘藍(lán)×白菜卻沒有效果，而Takeshita等［12］在甘藍(lán)和白菜雜交組合中的研究表明，胚搶救技術(shù)更適用于以甘藍(lán)為母本的雜交組合，考慮到以上情況，作者認(rèn)為在反交組合中應(yīng)該先利用子房培養(yǎng)，再進(jìn)行胚培養(yǎng)，能否獲得反交的雜種幼苗有待進(jìn)一步研究。

3.2胚培養(yǎng)的最適時(shí)間

本研究結(jié)果表明，在以青海大黃油菜為母本的組合中，雜交授粉后22 d取材進(jìn)行胚培養(yǎng)最易成功。由于各個(gè)組合胚胎敗育發(fā)生的時(shí)間不同，最適取材時(shí)間也就不同，因此胚搶救的最佳取材時(shí)期也許會(huì)因雜交組合的不同而不同，授粉后，過早或過遲取胚離體培養(yǎng)都不利于獲得雜種苗。這可能是因?yàn)榕咴谠缙诎l(fā)育比較小，不易從種子中分離以及胚的早期發(fā)育對(duì)營養(yǎng)條件要求很嚴(yán)格，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基無法滿足其要求，因而離體培養(yǎng)難以成功；而授粉后時(shí)間過于延長，雜種核與細(xì)胞質(zhì)的代謝或雜種胚胎與胚乳的發(fā)育不協(xié)調(diào)性增強(qiáng)，導(dǎo)致雜種胚凋亡，無法挽救，因此，適時(shí)將雜種胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境及發(fā)育的外界環(huán)境，可能有利于降低代謝的不協(xié)調(diào)性，提高胚培養(yǎng)成功率［13］。

3.3染色體加倍效果

染色體加倍對(duì)遠(yuǎn)緣雜種的保存和利用具有較重要的意義。在本試驗(yàn)中通過秋水仙素處理并未獲得染色體加倍的植株。在前人人工合成甘藍(lán)型油菜的研究中，也發(fā)現(xiàn)個(gè)別組合雜種難以加倍，比如DB（白菜型油菜）×T4（羽衣甘藍(lán)）的雜種，即使后來在現(xiàn)蕾期用0.5%的秋水仙素溶液浸根4 h也沒有加倍成功［14］。本次試驗(yàn)中加倍處理時(shí)間不足，加之秋水仙素有一定的毒害作用，導(dǎo)致幼苗沒有加倍或加倍后被毒害死亡，原因和加倍方法的改進(jìn)有待進(jìn)一步研究。在沒有進(jìn)行加倍處理的植株中也未發(fā)現(xiàn)自然加倍植株，說明人工芥菜型油菜的加倍效率較低。

3.4芥菜型油菜人工合成種應(yīng)用前景

青海大黃油菜屬白菜型油菜地方品種，子粒鮮黃、千粒重高（6.6 g）、含油量高（41.09%）、自交親和性強(qiáng)（親和指數(shù)為11.85）、皮殼率低（12.8%）、粒色性狀遺傳穩(wěn)定，是一個(gè)優(yōu)良的黃子種質(zhì)資源［15］。本試驗(yàn)從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)對(duì)雜種進(jìn)行了真假雜種鑒定，同時(shí)采用了SSR分子標(biāo)記法進(jìn)一步證明了該雜種是真雜種，為進(jìn)一步將青海大黃油菜的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)入芥菜型油菜中奠定了基礎(chǔ)，達(dá)到拓寬芥菜型油菜種質(zhì)資源的目的。

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