產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171產(chǎn)丙酸發(fā)酵動力學(xué)研究

曾美端， 洪藝萍， 蔡玉鳳， 周明煬， 成立文， 鄭 毅,3*

(1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福州工業(yè)微生物科技有限公司，福建 福州 350007；3.福建師范大學(xué) 工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

丙酸是重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、塑料、香料、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1]。丙酸的鈣、鈉和鉀鹽可用作防腐劑，是世界上公認(rèn)的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且十分安全的食品添加劑[2-3]。丙酸可通過化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法合成效率高，但副產(chǎn)物治理難度大、治理成本較高[4]。微生物發(fā)酵法具有反應(yīng)條件溫和、菌種易得、易于培育、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，微生物發(fā)酵法成為了丙酸生產(chǎn)的主要方法。近年來，對于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：一是耐酸菌株的篩選，孫丹等[5-6]通過壓力篩選的方法，獲得了一株耐25 g/L丙酸的產(chǎn)酸丙酸桿菌；二是耐酸機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)確定基于氨基酸代謝的耐酸系統(tǒng)是其響應(yīng)丙酸脅迫的主要調(diào)控元件[7]；三是發(fā)酵過程的優(yōu)化，通過研究培養(yǎng)基組分對發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以葡萄糖和甘油為混合培養(yǎng)基碳源時(shí)，丙酸產(chǎn)量提高了26.36%[8]；四是衍生物的開發(fā)利用，丙酸鹽如丙酸鈣等因?qū)γ咕脱堪麠U菌有良好的抑制作用，常用做谷物和飼料的防腐及食品的保鮮[9-10]；但在發(fā)酵動力學(xué)研究方面未見相關(guān)報(bào)道。通過發(fā)酵動力學(xué)的研究和發(fā)酵模型的建立，能夠進(jìn)一步了解發(fā)酵過程中菌體生長與產(chǎn)物形成的機(jī)制，以及環(huán)境因素對這些機(jī)制的影響，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的有效控制，達(dá)到提高產(chǎn)物發(fā)酵指標(biāo)的目的[11]。本研究針對產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidogenes) FS1171產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵過程，利用經(jīng)典發(fā)酵動力學(xué)模型和Origin軟件優(yōu)選模型方程，分別構(gòu)建產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵菌體生長模型、丙酸生成模型和底物甘油消耗模型。通過擬合方程可以預(yù)測菌體生長量、丙酸生成量以及甘油消耗情況，為進(jìn)一步放大試驗(yàn)，優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidogenes)FS1171，由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心新資源開發(fā)課題組實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①種子培養(yǎng)基：甘油5，蛋白胨5，酵母膏10，K2HPO42.5，KH2PO41.5，水1 000 mL，10% KOH調(diào)pH 6.8～7.2；②發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油40，蛋白胨5，酵母膏10，K2HPO42.5，KH2PO41.5，水1 000 mL，10% KOH調(diào)pH 6.8～7.2。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 甘油、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈣、氫氧化鉀、乙腈、磷酸氫二鈉、磷酸(分析純)。高效液相色譜儀(20AD，日本島津公司)；立式蒸汽壓力滅菌器(GI54DWS，致微(廈門)儀器有限公司)；臺式離心機(jī)(TDZ4-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；超凈工作臺(ZHJH-C1112B，上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 丙酸發(fā)酵培養(yǎng)方法 ①一級活化種子液制備：將甘油保存的FS1171菌種接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，獲得活化一級種子液；②二級種子液制備：將一級活化種子液按5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的種子培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，獲得液體發(fā)酵的二級種子液；③丙酸發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，發(fā)酵期間每隔24 h測定pH，同時(shí)用25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ca(OH)2溶液將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)至6.8～7.2。

1.2.2 分析方法 ①生物量的測定：采用核酸法測定[12]，用菌體的核酸量作為生物量測定的指標(biāo)；②甘油濃度的測定：采用比色法測定發(fā)酵液中甘油的殘余量[13]；③丙酸濃度的測定：采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行測定[14]。

1.2.3 發(fā)酵過程曲線的繪制 產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171在產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵過程中每隔24 h取樣，用1.2.2的方法進(jìn)行菌體生物量、丙酸生成量和底物甘油消耗量的測定。選用Origin 8.6軟件制作產(chǎn)酸丙酸桿菌的發(fā)酵過程曲線。

1.2.4 經(jīng)典模型丙酸桿菌發(fā)酵動力學(xué)的建立 應(yīng)用Origin 8.6軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性高級擬合分析，求解得出動力學(xué)模型參數(shù)，建立菌體生長、丙酸生成量和甘油消耗的動力學(xué)模型方程[14]。

①菌體生長動力學(xué)模型的建立：菌體生長動力學(xué)模型建立最常見的是Logistic模型和Monod方程。Logistic模型是一個(gè)非常典型的S型曲線方程，常被用來描述菌體濃度與營養(yǎng)物質(zhì)之間的非線性關(guān)系[15]。采用Logistic方程構(gòu)建丙酸發(fā)酵菌體生長的動力學(xué)模型。

(1)

方程式(1)積分得：

(2)

式中：X為菌體生物量(g/L)；μm為菌體最大比生長率(d-1) ；Xm為最大菌體生物量(g/L)；X0為初始菌體生物量(g/L)；t為發(fā)酵時(shí)間(d )。

②產(chǎn)物丙酸合成動力學(xué)模型的建立：在微生物丙酸生物合成過程，選用經(jīng)典的Luedeking-piret方程構(gòu)建動力學(xué)模型，公式如下：

(3)

因?yàn)楱弧?，β≠0，結(jié)合公式(2)和(3)，方程可化為：

(4)

式中：P0代表初始丙酸的產(chǎn)量，P0=0 ，X0對產(chǎn)量的影響可以忽略不計(jì)，方程可簡化為：

(5)

式中：ɑ、β為生長偶聯(lián)參數(shù)；t為發(fā)酵時(shí)間(d)；P為丙酸濃度(g/L)。

③底物甘油消耗動力學(xué)模型的建立：選用Dose-Resp模型分析甘油的消耗過程，方程式為：

(6)

積分得：

(7)

式中：S為甘油的濃度(g/L) ；S0為初始甘油濃度(g/L)；X為菌體生物量(g/L)；t為發(fā)酵時(shí)間(d)；P為產(chǎn)物丙酸濃度(g/L)；M0為菌體細(xì)胞維持相關(guān)常數(shù)；YX/S為最大細(xì)胞得率數(shù)；YP/S為產(chǎn)物丙酸得率系數(shù)。

1.2.5 Origin軟件篩選最優(yōu)數(shù)學(xué)模型構(gòu)建丙酸發(fā)酵動力學(xué)模型 采用Origin 8.6軟件運(yùn)用不同的模型(Logistic方程和BoLtzmann方程)對菌體生長動力學(xué)模型、產(chǎn)物生成動力學(xué)模型和底物消耗的動力學(xué)模型進(jìn)行擬合。

(8)

式中：A1為初始的菌體濃度；A2為最終的菌體濃度；X0、p為方程系數(shù)。

(9)

式中：A1為初始的菌體濃度；A2為最終的菌體濃度；X0、dx為方程系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵過程

產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵過程中生物量(X)、丙酸產(chǎn)量(P)、甘油消耗(S)隨發(fā)酵進(jìn)程時(shí)間(t)的變化情況見圖1，發(fā)酵過程中菌體很快就進(jìn)入對數(shù)生長期。在對數(shù)生長期內(nèi)，菌體迅速生長并伴隨甘油的顯著下降，丙酸合成，96 h后菌體生長緩慢后趨于穩(wěn)定，為生長的穩(wěn)定期。發(fā)酵后期，由于沒有補(bǔ)充甘油以及丙酸的積累，限制了細(xì)胞繼續(xù)生長及其代謝活動，影響了丙酸的生成，菌體量也有所下降[16-18]。發(fā)酵10 d后，菌體生物量為0.323 g/L，丙酸生成量為37.58 g/L。在發(fā)酵過程中定期調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，則有利于維持菌體的生長代謝活動和丙酸的生成[19]。由此可知，產(chǎn)酸丙酸桿菌在發(fā)酵過程中，甘油的消耗和丙酸的合成符合菌體生長的代謝規(guī)律。

圖1 產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171產(chǎn)丙酸分批發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curve of Propionibacterium acidogenic FS1171 producing propanoic acid

2.2 基于經(jīng)典發(fā)酵動力學(xué)丙酸發(fā)酵動力學(xué)模型的構(gòu)建

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型 選用Logistic方程來擬合丙酸桿菌的菌體生長動力學(xué)模型，積分公式為式(2)。利用Origin 8.6對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，得丙酸桿菌菌體生長動力學(xué)參數(shù)為X0=0.038 5，Xm=0.328 7，μm=1.830 8。將相關(guān)參數(shù)代入式(2)得菌體生長的動力學(xué)方程如下：

(10)

菌體的生長動力學(xué)曲線如圖2所示，R2為0.949 3，圖中可以看出實(shí)驗(yàn)值和Logistic方程擬合的數(shù)據(jù)能夠很好地吻合，可以較好地描述丙酸桿菌菌體生長過程。

圖2 菌體生長擬合曲線Fig.2 Growth fitting curve of strain FS1171 producing propanoic acid

2.2.2 丙酸合成動力學(xué)模型 丙酸合成動力學(xué)模型選用經(jīng)典的Luedking-piret方程來描述，積分公式為式(5)。將丙酸桿菌發(fā)酵過程中丙酸生成量的變化數(shù)據(jù)代入Origin 8.6進(jìn)行非線性擬合，得丙酸合成動力學(xué)參數(shù)為α=51.357 2，β=8.153 6，為部分相關(guān)型發(fā)酵，丙酸生成存在與菌體生長相聯(lián)與不相聯(lián)部分[20]。將α、β的數(shù)值帶入式(5)，獲得丙酸的濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系式，結(jié)果如下：

(11)

丙酸合成的擬合曲線如圖3所示，R2為0.979 9，由圖3可知菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期后，丙酸生成量的增長也呈較穩(wěn)定增長趨勢，實(shí)驗(yàn)值和Luedking-Piret方程擬合的數(shù)據(jù)能夠較好地吻合，可以較好地描述丙酸生成過程。

圖3 丙酸生成量擬合曲線Fig.3 Fitting curve of propionic acid production of strain FS1171

2.2.3 甘油消耗動力學(xué)模型 采用Dose-Resp模型來分析發(fā)酵底物甘油的消耗過程，積分公式為式(7)。將丙酸桿菌發(fā)酵過程甘油消耗的變化數(shù)據(jù)代入Origin 8.6進(jìn)行非線性擬合，得底物消耗動力學(xué)參數(shù)為S0=32.333 2，1/Y(X/S)=234.955 2，1/Y(p/S)=-3.511 9，M0=26.545 3；將相關(guān)數(shù)值代入公式(7)得：

S(t)=41.39-54.593 8*X(t)+

(12)

甘油消耗擬合曲線如圖4所示，R2為0.981 5，從圖4中可以看出實(shí)驗(yàn)值和Dose-Resp方程擬合的數(shù)據(jù)能夠較好地吻合，可以較好地描述底物消耗過程。

圖4 底物消耗擬合曲線Fig.4 Substrate consumption fitting curve of strain FS1171

2.2.4 模型的驗(yàn)證 表1是基于經(jīng)典發(fā)酵動力學(xué)模型(Logistic、Luedeking-Piret、Dose-Resp方程)構(gòu)建的模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的比較。從表1中可以看出，模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值之間的誤差率大都在10%以下，雖然在發(fā)酵末期，甘油消耗模型的擬合值與實(shí)驗(yàn)值之間已達(dá)到10%以上，但此時(shí)甘油濃度很低且到后面保持不變，此后的甘油濃度對發(fā)酵結(jié)果影響不大。因此，該發(fā)酵動力學(xué)方程構(gòu)建的模型能較好地描述產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171發(fā)酵過程中菌體生長、丙酸合成以及甘油消耗的變化規(guī)律。

表1 基于經(jīng)典發(fā)酵動力學(xué)方程構(gòu)建模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的驗(yàn)證比較Table 1 Verification comparison of fitting value and experimental value of model based on classical fermentation kinetic equation

2.3 基于Origin軟件篩選最優(yōu)數(shù)學(xué)模型構(gòu)建丙酸發(fā)酵動力學(xué)模型

2.3.1 不同動力學(xué)模型方程的篩選與評價(jià) 采用Origin 8.6軟件中的兩種模型(Logistic和Boltzmann方程)分別對菌體生長、丙酸合成以及甘油消耗的動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，評價(jià)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，Boltzmann模型的擬合效果比Logistic更為理想，能更好地描述產(chǎn)酸丙酸桿菌FS1171在發(fā)酵過程中菌體生長、丙酸合成以及甘油消耗的情況。

表2 兩種模型發(fā)酵動力學(xué)擬合評價(jià)Table 2 Fitting evaluation of fermentation kinetics for two models

2.3.2 基于Boltzmann方程構(gòu)建擬合曲線 根據(jù)Boltzmann方程構(gòu)建菌體生長、丙酸合成及甘油消耗的動力學(xué)模型擬合曲線，結(jié)果如圖5～圖7所示，其擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.992 3、0.998 3和0.997 6，可以很好地反映菌體生長、丙酸合成以及甘油消耗的發(fā)酵過程。

圖5 基于Boltzmann FS1171模型生長擬合曲線Fig.5 Growth fitting curve of strain FS1171 based on Boltzmann model

圖6 基于Boltzmann模型的丙酸生成擬合曲線Fig.6 Fitting curve of propionic acid production based on Boltzmann model

圖7 基于Boltzmann模型的底物消耗擬合曲線Fig.7 Substrate consumption fitting curve based on Boltzmann model

2.3.3 模型的驗(yàn)證 表3是基于Boltzmann方程構(gòu)建的模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的比較。同表1出現(xiàn)類似的現(xiàn)象，在參數(shù)低濃度區(qū)域擬合相對誤差較大，出現(xiàn)一定失真，這可能是構(gòu)建模型應(yīng)該注意的，好在低濃度區(qū)域?qū)φ麄€(gè)發(fā)酵過程相對影響度較少。

表3 基于Boltzmann方程構(gòu)建模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的驗(yàn)證比較Table 3 Verification comparison of fitting value and experimental value of model based on Boltzmann equation

3 討 論

基于經(jīng)典發(fā)酵動力學(xué)模型(Logistic、Luedeking-Piret、Dose-Resp方程，簡稱方法Ⅰ)成功構(gòu)建產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidogenes) FS1171丙酸分批發(fā)酵過程中菌體生長、丙酸合成及甘油消耗的動力學(xué)模型，其擬合度R2分別為0.949 3、0.979 9和0.981 5，數(shù)值均大于0.9，說明模型能夠很好地反映該菌丙酸發(fā)酵動力學(xué)。通過比較3個(gè)模型的擬合值和實(shí)驗(yàn)值可以發(fā)現(xiàn)，擬合相對誤差較大的區(qū)域主要發(fā)生在參數(shù)低濃度區(qū)域，如菌體生長的前期、產(chǎn)物合成的初期與底物消耗的末期，主要原因在于方程主要反映菌體濃度的增加和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗對自身生長的抑制與對產(chǎn)物合成的影響。在低濃度區(qū)域，這些參數(shù)變化幅度不明顯，因此擬合情況相對不夠理想。

基于Boltzmann方程(簡稱方法Ⅱ)構(gòu)建的動力學(xué)模型，其擬合度R2均大于0.95，在參數(shù)低濃度區(qū)域擬合相對誤差也較大。對比兩種發(fā)酵動力學(xué)構(gòu)建方法，方法Ⅰ所構(gòu)建模型擬合度(R2值)均小于方法Ⅱ擬合度(R2值)，前者模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值之間的誤差率大都在10%以下，而后者模型的偏差率大都在5%以下，因此明顯發(fā)現(xiàn)前者所構(gòu)建模型擬合度整體不如后者，但前者所構(gòu)建的丙酸生成與底物消耗模型都是以菌體生長動力學(xué)模型為基礎(chǔ)的，3個(gè)模型之間有較好的關(guān)聯(lián)性及參數(shù)解析，而方法Ⅱ構(gòu)建的3個(gè)模型參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性較差，呈現(xiàn)一定獨(dú)立性，仍需對參數(shù)含義進(jìn)一步解讀，以期獲得更好的應(yīng)用效果。

通過丙酸發(fā)酵過程動力學(xué)研究，可更準(zhǔn)確地對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化，并可利用小實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)大型的發(fā)酵工藝，為進(jìn)一步放大實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。Zakeri等[21]利用非結(jié)構(gòu)模型建立的動力學(xué)方程可以成功預(yù)測甘蔗糖蜜生產(chǎn)黃原膠的發(fā)酵過程，為黃原膠的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。現(xiàn)有報(bào)道通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面法來實(shí)現(xiàn)丙酸發(fā)酵過程的優(yōu)化[22-25]，但通過構(gòu)建丙酸發(fā)酵動力學(xué)模型來進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化的研究未見相關(guān)報(bào)道。今后的試驗(yàn)可以進(jìn)一步從優(yōu)化發(fā)酵工藝入手，對補(bǔ)料發(fā)酵過程進(jìn)行系統(tǒng)化的研究，構(gòu)建補(bǔ)料發(fā)酵的動力學(xué)模型，獲得良性循環(huán)的補(bǔ)料策略，為丙酸桿菌實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)甚至應(yīng)用于連續(xù)發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。