廣西虎紋捕鳥蛛毒成分的氨基酸測定及紅外光譜定性分析

劉圓圓 黃新 謝賽華 譚芳 張崢崢 劉磊

·論著·

廣西虎紋捕鳥蛛毒成分的氨基酸測定及紅外光譜定性分析

劉圓圓 黃新 謝賽華 譚芳 張崢崢 劉磊

目的通過質(zhì)量分析的方法初步鑒定蛛毒的毒素化學(xué)成分。方法采用氨基酸自動(dòng)分析儀對蛛毒的多種氨基酸成分進(jìn)行定性及定量的研究，并且輔以紅外光譜法進(jìn)行定性研究。結(jié)果通過氨基酸測定法從虎紋捕鳥蛛中鑒定到谷氨酸、胱氨酸、賴氨酸含量較多，分別為8.15%、7.86%、7.64%，氨基酸總量為55.93%；從樣品粉末的紅外光譜可知：該化合物可能含-C-H，-OH，N-H，-CO-N-H，苯環(huán)等主要氨基酸基團(tuán)。結(jié)論結(jié)果表明該鑒別方法操作簡便、專屬性強(qiáng)，可用于蛛毒的定性鑒別和含量測定，初步建立了虎紋蛛毒成分的定性鑒定研究方法。

虎紋蛛毒；氨基酸測定；紅外光譜

當(dāng)今對蜘蛛毒素的研究，已成為繼蛇毒、蝎毒后的又一研究熱點(diǎn)。本文通過研究旨在分析虎紋捕鳥蛛毒毒素的成分，為臨床應(yīng)用提供必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。蜘蛛作為藥用，據(jù)唐朝陳藏器的《本草拾遺》記載，藥用蜘蛛“主一切疔腫附骨疽蝕等瘡，宿肉贅瘤”?；⒓y捕鳥蛛Selenocosmiahuwena，最近被鑒定為蜘蛛新種，屬于捕鳥蛛科Theraphosidae[1]，主產(chǎn)于海南、廣西寧明一帶[2]。從虎紋捕鳥蛛中分離純化的粗毒作為一種天然的毒素，它是由神經(jīng)毒性肽、蛋白質(zhì)和低分子量物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜混合物,具有抗腫瘤，鎮(zhèn)痛[3]等多種活性。虎紋蛛毒素的化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì)類、酶、多胺、氨基酸、核苷酸等[4]。本研究主要應(yīng)用紅外光譜及氨基酸測序法對虎紋蛛毒的化學(xué)成分初步分析。

1 原料藥材

廣西虎紋捕鳥蛛毒素(螯肢末端的毒腺分泌的毒液提取)從廣西南方蜘蛛毒研究所提取、及購買于廣州中醫(yī)藥大學(xué)。將蛛毒粉末樣品置于冰箱中4℃凍存，備用。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

IR NEXUS470型傅立葉紅外分光光度計(jì)(美國尼高力儀器公司)；METTLER-AE100電子分析天平(瑞士METTLER公司)；L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本日立公司)；甲醇(AR)(批號(hào)：20070127，上海試一化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(AR)(批號(hào)：20090616，成都市科隆化工試劑廠)；丙酮(AR)(批號(hào)：20030902，中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；淀粉酶(鄭州中興添加劑有限公司)；茚三酮(上海科豐化學(xué)試劑公司)。

3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 氨基酸測定

3.1.1 原理 氨基酸的組分分析，現(xiàn)在廣泛地采用離子交換法，并由自動(dòng)化的儀器來完成。其原理是利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進(jìn)行分離。當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的pH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來，即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸；摩爾質(zhì)量小的比摩爾質(zhì)量大的先被洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。定量測定的依據(jù)是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物(570 nm)的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物(440 nm)，故需在另外波長處定量測定。

3.1.2 樣品處理 測定樣品中各種游離氨基酸含量，可以除去脂肪雜質(zhì)后，直接上柱進(jìn)行分析；測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時(shí)樣品必須經(jīng)酸水解。稱取干燥的蛋白質(zhì)樣品數(shù)毫克，加入5.7 mol/L鹽酸2 ml，置于110℃烘箱內(nèi)水解24小時(shí)，然后除去過量的鹽酸，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻，使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進(jìn)行分析。如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機(jī)鹽等雜質(zhì)，必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進(jìn)行酸水解處理。

3.1.3 樣品分析 經(jīng)過處理后的樣品上柱進(jìn)行分析，上柱的樣品量根據(jù)所用自動(dòng)分析儀的靈敏度來確定，一般為每種氨基酸0.1 μmol左右(水解樣品干重為0.3 mg左右)。測定必須在pH 5～5.5、100℃下進(jìn)行，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間為10～15分鐘，生成的紫色物質(zhì)在570 nm波長下進(jìn)行比色測定，而生成的黃色化合物在440 nm波長下進(jìn)行比色測定。

3.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測定及分析結(jié)果見表1。

表1 蛛毒粉末樣品的氨基酸測定結(jié)果

3.2 紅外光譜法

3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 樣品壓片：取干燥的樣品粉末約1 mg，置瑪瑙研缽中磨細(xì)，然后加入干燥的溴化鉀約100 mg，經(jīng)充分研磨，使之粒度細(xì)小，混合均勻，參照空白壓片法進(jìn)行壓制，即得樣品壓片。(為了防止樣品變潮，整個(gè)過程應(yīng)該盡可能在紅外光下進(jìn)行)。先將空白片置于儀器的樣品光路中，進(jìn)行掃描得參比光譜圖，再將樣品片置于儀器的樣品光路中，進(jìn)行掃描后即得到樣品的紅外光譜圖。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 紅外實(shí)驗(yàn)主要考察分辨率和掃描次數(shù)兩個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)無論是在分辨率為4或8，均為掃描次數(shù)為25的時(shí)候圖譜較佳，不僅峰形好，而且基線比較平穩(wěn)。同時(shí)，在分辨率為4掃描次數(shù)為25的紅外光譜圖比分辨率為8掃描次數(shù)為25的紅外光譜圖的基線更平穩(wěn)，所以最終選擇分辨率為4掃描次數(shù)25為進(jìn)行紅外光譜的條件，結(jié)果見圖1和表2。

圖1 分辨率為4、掃描次數(shù)為25的蛛毒粉末樣品紅外光譜圖

表2 蛛毒粉末樣品的紅外光譜測定數(shù)據(jù)

紅外光譜解析：(1)3292 cm-1：3500～3000 cm-1之間的這個(gè)大峰有可能是-OH和N-H和-C-H的伸縮振動(dòng)峰。(2)1616 cm-1和1554 cm-1：苯環(huán)的骨架振動(dòng)峰和羰基的伸縮振動(dòng)峰。(3)3070 cm-1和2962 cm-1：芳?xì)涞纳炜s振動(dòng)峰。(4)1399 cm-1和1241 cm-1：酰胺中的C-N的伸縮振動(dòng)峰和-C-H的彎曲振動(dòng)峰。從樣品粉末的紅外光譜可知：該化合物可能含-C-H，-OH，N-H，-CO-N-H，苯環(huán)等主要氨基酸基團(tuán)。

4 討論

4.1 氨基酸測定

氨基酸測定主要是將處理好的游離氨基酸樣品用日立L-8800型全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行18種氨基酸的測定，氨基酸總量為55.93%。用離子交換層析的原理將各種氨基酸分離、洗脫，被洗脫的各種氨基酸與茚三酮產(chǎn)生顏色反應(yīng)，并由分光光度計(jì)自動(dòng)定量測定各個(gè)氨基酸的含量。整個(gè)過程實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，操作簡單，不僅可以對氨基酸進(jìn)行定性分析，而且可以對各種氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確的含量測定，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥質(zhì)量監(jiān)控、生化研究、臨床檢測等領(lǐng)域。顯色反應(yīng)用的茚三酮試劑，隨著時(shí)間推移發(fā)色率會(huì)降低，故在較長時(shí)間測樣過程中應(yīng)隨時(shí)采用已知濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液上柱測定以檢驗(yàn)其變化情況。

采用反相色譜原理制造的氨基酸分析儀，可使蛋白質(zhì)水解出的18種氨基酸在12分鐘內(nèi)完成分離，且具有靈敏度高(最小檢出量可達(dá)1 pmol)、重現(xiàn)性好以及一機(jī)多用等優(yōu)點(diǎn)。

4.2 紅外光譜法

紅外光譜法不僅操作簡便，而且具有很高的分辨率和極快的掃描速度，它正在被各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域很廣泛的應(yīng)用。隨著傅立葉變換紅外光譜和計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用紅外光譜技術(shù)可直接獲取化學(xué)信息，可快速鑒別化學(xué)物品的優(yōu)劣，也可為初步的化學(xué)成分的提取提供指導(dǎo)[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛛毒粉末在紅外光譜中有特征的吸收峰，該吸收峰為氨基酸的主要基團(tuán)，可以為蛛毒初步化學(xué)成分的鑒別提供輔助依據(jù)。

5 結(jié)論

采用氨基酸自動(dòng)分析儀對蛛毒粉末樣品的多種氨基酸成分進(jìn)行定性及定量的方法簡便可行；蛛毒粉末樣品的紅外光譜顯示蛛毒樣品具有多種氨基酸特征吸收峰。本課題對虎紋捕鳥蛛的化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，完成了對其粗毒的基本波譜分析、主要成分結(jié)構(gòu)的初步鑒定等基礎(chǔ)性研究工作，為尋找新的抗腫瘤藥物和進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系、藥理學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

[1]王家福，彭賢錦，謝莉萍．我國南方捕鳥蛛一新種(蜘蛛目：捕鳥蛛科)[J]．湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1993，16(1)：72．

[2]潘紅平，蒙健宗，徐蘊(yùn)麗，等.虎紋捕鳥蛛毒素的提取及毒力的測定[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，1999，18(4)：274-277.

[3]周鴻雁，毛海峰，陳嘉勤，等.虎紋鎮(zhèn)痛肽對腦缺血損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的研究[J].湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，18(3)：50-52．

[4]李順意，梁松平.虎紋捕鳥蛛毒液中透明質(zhì)酸酶的純化和部分性質(zhì)的研究[J].生物化學(xué)雜志，1995，11(2)：155-160.

[5]李發(fā)美.分析化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：252-272.

(本文編輯：董歷華)

AminoacidassayoftoxinfromthespiderGuangxiSelecnocosmiaHuwenaandqualitativeanalysisbyinfraredspectrometry

LIUYuan-yuan，HUANGXin，XIESai-hua，etal.

GuilinTraditionalChineseMedicalHospital，Guilin541002，China

HUANGXin，E-mail：nnhuangxin@163.com

ObjectivePreliminary identification of the chemical composition of toxin from the spider GuangxiSelenocosmiaHuwenawith the method of quality analysis.MethodsAutomatic amino acid analyzer on a variety of amino acid composition of spider poisons was adopted to perform a qualitative as well as quantitative research, and the former was supplemented by infrared spectrometry .ResultsBy using amino acids analysis the chemical composition of GuangxiSelenocosmiaHuwenatoxin was identified, and the finding was the spider GuangxiSelenocosmiaHuwenacontains higher levels of glutamic acid, cystine, lysine, which were 8.15%, 7.86%,and 7.64%, respectively, and the total amino acids was 55.93%. The infrared spectrometry showed that the sample powder may contain-C-H,-O-H, N-H,-CO-N-H, benzene ring and other major amino group.ConclusionThe results showed that the identification method, being simple, and specific, could be used for spider poison qualitative identification and determination, and the specific approaches for such method was tentatively established.

SelenocosmiaHuwenatoxin；Amino acids assay；Infrared spectrometry

廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZKZ10-056)

541002桂林市中醫(yī)院藥劑科(劉圓圓、謝賽華、譚芳)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)外科(黃新、張崢崢、劉磊)

劉圓圓(1985-)，女，碩士，藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：275189113@qq.com

黃新(1960-)，本科，教授。研究方向：腦腫瘤手術(shù)治療。E-mail：nnhuangxin@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.006

2013-9-30)