茶花和佛手膠孢炭疽菌對(duì)不同類型殺菌劑敏感性研究

余柯達(dá)， 路 梅， 葉美娟， 凌丹燕

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)是引起植物炭疽病的病原真菌，可侵染花、果實(shí)、葉片和枝梢等植物各個(gè)器官，常引起落花、落葉、落果、枝梢枯死、樹(shù)皮爆裂、貯藏期果實(shí)腐爛等癥狀，造成樹(shù)勢(shì)衰弱及減產(chǎn)減收[1-2]．目前，對(duì)植物炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主，但是由于連續(xù)多年單一性殺菌劑的大量使用，導(dǎo)致該病菌在不少地區(qū)出現(xiàn)了較強(qiáng)的抗藥性，致使農(nóng)藥的效果大幅下降[3]．已有研究表明，芒果和油茶的炭疽病病原真菌已對(duì)苯并咪唑類殺菌劑多菌靈等產(chǎn)生了抗性[4-5]．對(duì)芳香樟炭疽病的防治研究也發(fā)現(xiàn)，多年使用的保護(hù)性殺菌劑波爾多液對(duì)病害的防治效果已經(jīng)很低[6]．殺菌劑主要分為3類：一類是具有高效內(nèi)吸作用的內(nèi)吸型殺菌劑，如苯并咪唑類殺菌劑多菌靈；另一類是具有保護(hù)治療作用的保護(hù)型殺菌劑，如二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲；第3類是具有復(fù)合防治作用的殺菌劑，如低毒的三唑類新一代強(qiáng)力殺菌劑苯甲丙環(huán)唑．有效中濃度或半數(shù)有效濃度(median effect concentration，EC50)是衡量殺菌劑毒力的重要指標(biāo)，其值大小的改變程度是產(chǎn)生抗藥性的標(biāo)志[7]．

浙江省金華市是國(guó)內(nèi)茶花和佛手的主要產(chǎn)區(qū)之一，炭疽病發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響了植物的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值．迄今為止，對(duì)于佛手和四季茶花炭疽病防治中病原菌對(duì)殺菌劑敏感性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道．本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了3種類型6種殺菌劑對(duì)四季茶花和佛手炭疽病菌的室內(nèi)毒力，明確了病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性現(xiàn)狀，為科學(xué)防治植物炭疽病害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 菌株

茶花和佛手膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并保藏．

1.2 供試殺菌劑

1)保護(hù)型殺菌劑：2%波爾多液懸浮液SC(自配)；50%異菌脲懸浮劑FW(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)．

2)內(nèi)吸型殺菌劑：50%多菌靈可濕性粉劑WP(上海瀘聯(lián)生物藥業(yè)(夏邑)有限公司)；15%惡霉靈可濕性粉劑WP(陜西西大華特科技實(shí)業(yè)有限公司)．

3)復(fù)合型殺菌劑：80%多福鋅可濕性粉劑WP(河北冠龍農(nóng)化有限公司)；30%苯甲丙環(huán)唑乳油EC(青島潤(rùn)生農(nóng)化有限公司)．

1.3 供試殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定

根據(jù)使用說(shuō)明，將適量的殺菌劑溶入6 mL無(wú)菌水中，再加入到含54 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的錐形瓶中(培養(yǎng)基溫度為60 ℃左右)，混合均勻后倒平板，以無(wú)菌水作空白對(duì)照．將保藏的炭疽病病原菌活化培養(yǎng)，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，再在其菌落邊緣用滅菌的打孔器移取7 mm直徑的菌絲塊接種到帶藥平板培養(yǎng)基上，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照菌落直徑長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑的約2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落直徑平均值和菌絲生長(zhǎng)抑制率.菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式為

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成概率值(y)、殺菌劑濃度(x)，應(yīng)用Excel軟件求出各殺菌劑的毒力，按濃度與概率值回歸法求得線性回歸方程y=a+bx，并以回歸方程計(jì)算各供試殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病病原菌的抑制中濃度(EC50)[8]．

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑濃度設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用每種殺菌劑的濃度設(shè)置依據(jù)殺菌劑的使用說(shuō)明進(jìn)行系列室內(nèi)毒力測(cè)定預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定．以保護(hù)型殺菌劑50%異菌脲懸浮劑FW為例，圖1和圖2顯示了不同濃度的異菌脲對(duì)2株病原菌的抑制作用.由圖1和圖2可見(jiàn)，隨著異菌脲濃度的減少，病原菌的菌落直徑明顯增加.結(jié)合50%異菌脲懸

圖1 茶花炭疽病菌在不同濃度異菌脲作用下的生長(zhǎng)狀況圖

殺菌劑有效成分的質(zhì)量濃度/(mg5L-1)2%波爾多液懸浮液SC66.6750.0040.0028.5710.00/50%異菌脲懸浮劑FW255.00127.5085.0031.8812.755.1050%多菌靈可濕性粉劑WP1 000.00333.33100.0050.0025.0016.7715%惡霉靈可濕性粉劑WP1 500.001 000.00500.00100.0020.002.0080%多福鋅可濕性粉劑WP16.001.600.600.060.006/30%苯甲丙環(huán)唑乳油EC20.002.000.200.02//

注：有效成分質(zhì)量濃度的設(shè)置按照每種殺菌劑的使用說(shuō)明和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定．

浮劑防治炭疽菌等真菌病害的使用濃度(1 000～1 500倍液)，最終選擇的異菌脲使用濃度為255.00，127.50，85.00，31.88，12.75，5.10 mg/L．其他殺菌劑的抑菌實(shí)驗(yàn)存在同樣的趨勢(shì)．通過(guò)預(yù)試驗(yàn)最終確定的6種殺菌劑有效成分的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1．

2.2 保護(hù)型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定

保護(hù)型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2．由表2可見(jiàn)：2%波爾多液對(duì)茶花和佛手炭疽菌的EC50值差異較大，分別為105.848 2 mg/L和214.870 8 mg/L；50%異菌脲對(duì)2種病原菌的EC50則較為接近，分別為109.081 0 mg/L和105.525 7 mg/L．但是，2種殺菌劑對(duì)供試菌株的EC50均大于100 mg/L，說(shuō)明2種來(lái)源炭疽菌對(duì)2%波爾多液和50%異菌脲的敏感性較低，已經(jīng)產(chǎn)生了一定的抗藥性．

表2 保護(hù)型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

2.3 內(nèi)吸型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定

內(nèi)吸型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果由表3可見(jiàn)：2種殺菌劑對(duì)供試菌株的EC50值為2 163.898 1～4 260.781 5 mg/L，均大于1 000 mg/L．表示2種來(lái)源的供試菌株對(duì)內(nèi)吸型殺菌劑50%多菌靈和15%惡霉靈的敏感性非常低，已經(jīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性．

表3 內(nèi)吸型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

2.4 復(fù)合型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定

復(fù)合型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4．表4中，30%苯甲丙環(huán)唑和80%多福鋅對(duì)2株供試菌株的EC50值為2.287 8～10.408 0 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于保護(hù)型殺菌劑和內(nèi)吸型殺菌劑．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明茶花和佛手炭疽病原菌對(duì)2種殺菌劑的敏感性很高，進(jìn)而表明復(fù)合型殺菌劑適用于植物炭疽病的防治．

表4 復(fù)合型殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定中EC50越小、斜率越大,說(shuō)明病原菌對(duì)殺菌劑的反應(yīng)靈敏度越高，即隨著殺菌劑濃度的增加，抑制率明顯增大[9]．對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)回歸分析得出每種殺菌劑的毒力回歸方程和斜率，回歸方程的斜率與病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性成正比．供試6種殺菌劑對(duì)茶花和佛手炭疽病菌毒力回歸方程的斜率分別為：2%波爾多液0.545 6和0.229 8；50%異菌脲0.119 7和0.118 9；50%多菌靈0.021 6和0.013 1；15%惡霉靈0.013 4和0.011 9；30%苯甲丙環(huán)唑16.697和13.068；80%多福鋅5.465 8和4.426 6．綜合EC50和毒力回歸方程的斜率，可以得出以下結(jié)論：首先，2種來(lái)源的供試菌株對(duì)6種殺菌劑的敏感性大小順序依次為：30%苯甲丙環(huán)唑>80%多福鋅>2%波爾多液>50%異菌脲>50%多菌靈>15%惡霉靈；其次，2種來(lái)源的供試菌株對(duì)不同類型殺菌劑的敏感性差異較大，內(nèi)吸型殺菌劑的EC50值近乎是保護(hù)型殺菌劑的百倍、復(fù)合型殺菌劑的千倍．

多菌靈和甲基硫菌靈同屬于苯并咪唑類殺菌劑．國(guó)內(nèi)已有研究證明膠孢炭疽菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的敏感性低．例如，陳聃等[10]采用區(qū)分劑量法對(duì)浙江省葡萄炭疽病的抗藥性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株群體對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率為37.04%，且均為高水平抗藥性菌株(Ben HR)，即能在含殺菌劑 100 mg/L平板上生長(zhǎng)的菌株．本研究結(jié)果也證明，膠孢炭疽菌已經(jīng)對(duì)多菌靈等咪唑類內(nèi)吸型殺菌劑產(chǎn)生抗性；而且多菌靈對(duì)茶花和佛手的膠孢炭疽菌的EC50竟分別高達(dá)2 163.898 1和3 595.633 6 mg/L，說(shuō)明供試菌株的抗藥性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陳聃等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果．

膠孢炭疽菌具有潛伏侵染特性[11]，其分生孢子侵染和再侵染是病害發(fā)生和傳播的主要途徑．因此，殺菌劑對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制率的高低是病害控制的關(guān)鍵之一．2013年劉霞等[12]對(duì)核桃炭疽病原菌膠孢炭疽菌的室內(nèi)毒力研究發(fā)現(xiàn)，異菌脲等殺菌劑對(duì)分生孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用．本研究采用的菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了不同殺菌劑對(duì)菌株的抑菌作用，關(guān)于所用殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)率的影響研究正在進(jìn)行當(dāng)中．

綜上所述，建議：停用多菌靈等病原菌已經(jīng)產(chǎn)生抗性的內(nèi)吸型殺菌劑；生產(chǎn)實(shí)際中可用30%苯甲丙環(huán)唑和80%多福鋅這2種復(fù)合型殺菌劑進(jìn)行炭疽病害的防治，少用或輪換使用保護(hù)型殺菌劑．由于田間自然環(huán)境中病原物、寄主和環(huán)境之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，本研究所用殺菌劑在田間的抑菌效果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證．

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