秈稻“成恢448”組培體系的建立

孫青芝, 呂冰潔, 馬伯軍

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

水稻品種“成恢448”是由秈型恢復(fù)系871028與美國稻種Lemont雜交育成的新恢復(fù)系，具有較強(qiáng)的恢復(fù)力，與珍汕97A，岡46，Ⅱ-32A，D62A，K17A和大粒A等多個(gè)不育系測交后,F1代的平均結(jié)實(shí)率為83.39%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)量雜種優(yōu)勢.該恢復(fù)系也具有較好的廣親和性，與秈稻測驗(yàn)種南京11和IR36雜交,F1平均結(jié)實(shí)率為85.89%；同粳稻測驗(yàn)種巴利拉、秋光測交,F1平均結(jié)實(shí)率為69.04%[1].“成恢448”對(duì)稻瘟病具有抗性，但是卻不抗白葉枯病[1-2].本研究小組多年的大田接菌實(shí)驗(yàn)也表明，“成恢448”對(duì)白葉枯病多個(gè)菲律賓生理小種都顯現(xiàn)高度感病.“成恢448”非常適合抗白葉枯病轉(zhuǎn)基因育種的理論與應(yīng)用研究.目前，許多學(xué)者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法等將抗白葉枯病基因Xa21轉(zhuǎn)移到栽培品種臺(tái)北309[3]，IR72[4]，IR64和BG90-2[5]，以及明恢63、珍汕97B、鹽恢559[6]等，但成功的前提之一就是需要建立這些栽培品種的受體系統(tǒng).目前，粳稻日本晴、中花11等的組織培養(yǎng)體系已經(jīng)非常成熟[7-8]，但秈稻的愈傷組織誘導(dǎo)、繼代及分化都相對(duì)較難[9-11]，且不同品種的組培條件差異性也較大[12-14].所以，盡管已報(bào)道了93-11，IR24和IR6等多個(gè)秈稻品種的組培體系研究[15-16]，但是并不適用于所有的秈稻品種.本文利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理設(shè)計(jì)了不同激素濃度配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，優(yōu)化了秈稻“成恢448”的組織培養(yǎng)體系，為該強(qiáng)優(yōu)恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因育種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為秈稻抗白葉枯病基因的克隆與功能研究提供了一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化的受體.

1 材料與方法

1.1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代

用秈稻(Oryza sativa L. ssp. indica)“成恢448”的成熟種子，去殼，挑取顆粒飽滿的穎果，在超凈臺(tái)進(jìn)行如下操作：在70%乙醇溶液中浸種2 min，無菌水清洗3次，轉(zhuǎn)入30%次氯酸鈉溶液180 r·min-1震蕩30 min，無菌水清洗3次，再在1%過氧化氫溶液中180 r·min-1震蕩3 h，最后用無菌水清洗3～5次，放在無菌濾紙上干燥30 min.消毒干燥后的種子鋪在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中.誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS(Murashige & Skoog)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[17]，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麥芽糖、3 g/L植物凝膠，以及不同質(zhì)量濃度的萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和激動(dòng)素(KT)(各激素的質(zhì)量濃度見表1)，pH=5.8，在28 ℃恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h).誘導(dǎo)2周后，摘下愈傷組織，繼代培養(yǎng)，計(jì)算誘導(dǎo)率和每克愈傷組織增質(zhì)量，篩出最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件.

1.2 水稻愈傷組織的分化與植株再生

在超凈臺(tái)中，將繼代培養(yǎng)2周的愈傷組織置于不同的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.5 g/LL-谷氨酰胺、0.5 g/LL-脯氨酸、0.3 g/L酸解酪蛋白、30 g/L麥芽糖、3 g/L植物凝膠,以及不同質(zhì)量濃度的NAA、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和KT(各激素的質(zhì)量濃度見表2)，pH=5.8,在28 ℃恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h).2周后計(jì)算出綠率，1月后計(jì)算出苗率.

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的計(jì)算方法

愈傷組織誘導(dǎo)2周后，摘下愈傷組織，并稱出愈傷組織的質(zhì)量m1，繼代2周后稱出愈傷組織的質(zhì)量m2，計(jì)算每克愈傷組織的增質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

利用已報(bào)道的秈稻組織培養(yǎng)的技術(shù)參數(shù)[4,6-8]，誘導(dǎo)“成恢448”的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率非常低，愈傷組織質(zhì)量不好，且容易褐化.為了獲得“成恢448”組織培養(yǎng)的最佳體系，筆者利用正交實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)了不同激素3因素4水平的誘導(dǎo)培養(yǎng)基參數(shù)和3因素3水平的分化培養(yǎng)基參數(shù)，探索了該水稻品種最優(yōu)化的組培體系.

2.1 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長速率

激素2,4-D，NAA和KT在不同程度上能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo).根據(jù)3因素4水平正交實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)置了16種含有不同質(zhì)量濃度的NAA，2,4-D和KT的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見表1，編號(hào)1～16)，將“成恢448”的種子(成熟胚)接種到培養(yǎng)基上，生長5 d后開始誘導(dǎo)出淡黃色的愈傷組織，14 d長成大塊愈傷組織.經(jīng)統(tǒng)計(jì)，16種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率都在50%以上，其中8種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率達(dá)到70%以上，而4號(hào)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了93%.在不添加任何激素的對(duì)照培養(yǎng)基(見表1，編號(hào)17)上，種子只長根和芽，沒有愈傷組織形成.愈傷組織增質(zhì)量即愈傷組織生長速率，可以代表愈傷組織的活性[9].將誘導(dǎo)得到的愈傷組織摘下，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，計(jì)算每克愈傷組織增質(zhì)量.如表1所示：在4號(hào)培養(yǎng)基上每克愈傷組織增質(zhì)量最高，活性也較好；3號(hào)培養(yǎng)基次之；而其他培養(yǎng)基的每克愈傷組織增質(zhì)量均較低，活性較小.

表1 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長速率

不同配比的激素進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，三者表現(xiàn)為綜合作用.對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中“成恢448”成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)，雖然3號(hào)培養(yǎng)基上的每克愈傷組織增質(zhì)量最高，達(dá)到(5.09±0.27) g，但其誘導(dǎo)率卻不高，只有65.97%;而4號(hào)培養(yǎng)基上的每克愈傷組織增質(zhì)量僅次之，為(4.81±0.64) g，但其愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到93.54%.因此，4號(hào)培養(yǎng)基的激素配比(1.0 mg/L 2,4-D,4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT)最適宜“成恢448”成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代.

2.2 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的分化情況

選取4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，轉(zhuǎn)移到不同激素配比的分化培養(yǎng)基(見表2，編號(hào)18～26)上，15 d時(shí)統(tǒng)計(jì)出綠率，1月后統(tǒng)計(jì)分化率.由表2可知：“成恢448”愈傷組織的出綠率和成苗率普遍較低，雖然每種培養(yǎng)基都能促進(jìn)少許愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)，但絕大部分培養(yǎng)基上的出綠率均在10%以下，成苗率也較低，或沒有成苗(如編號(hào)18，20，22，26)；而25號(hào)培養(yǎng)基上的出綠率和成苗率分別達(dá)到了32.4%和6.0%，高出其他培養(yǎng)基上的數(shù)倍，即1.0 mg/L NAA，2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L KT適宜“成恢448”愈傷組織的分化與植株再生.

“成恢448”成熟胚的組培過程如圖1所示.

表2 不同激素配比下“成恢448”愈傷組織的分化

圖1 “成恢448”成熟胚的組培過程

3 討 論

植物生長調(diào)節(jié)劑在愈傷組織的誘導(dǎo)和分化中起著很大的作用，植物生長素/細(xì)胞分裂素的比率高通常促進(jìn)愈傷組織的萌發(fā)，而比率低則促進(jìn)愈傷組織的分化.植物生長素2,4-D或NAA對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖是必需的[18-23].另外，文獻(xiàn)[24]和[25]分別證明了2,4-D與KT配合使用更能促進(jìn)胚性愈傷組織的形成，而單獨(dú)使用2,4-D得到的只是無胚性的愈傷組織.本實(shí)驗(yàn)中，用不添加任何激素的MS培養(yǎng)基(見表1，編號(hào)17)誘導(dǎo)“成恢448”愈傷組織時(shí)，沒有愈傷組織形成，只瘋長根和苗，而在培養(yǎng)基中添加2,4-D，NAA和KT后均有數(shù)量不等的愈傷組織形成，表明在培養(yǎng)基中添加適量的2,4-D，NAA和KT確實(shí)有利于愈傷組織的萌發(fā)，這與文獻(xiàn)[15]對(duì)7種秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的研究結(jié)果是一致的.雖然這3種激素的混合能在不同程度上誘導(dǎo)愈傷組織，但激素間不同濃度的搭配更加至關(guān)重要.當(dāng)2,4-D的質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果均良好，且在1.0 mg/L時(shí)每克愈傷組織增質(zhì)量最大，為5.09 g,基本與水稻93-11的5.86 g[26]齊平.而NAA的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)則越高越好，表1中16種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率均不錯(cuò)，全在50%以上，甚至最高的達(dá)到了90%以上，超過了粳稻日本晴[7,26].當(dāng)KT的質(zhì)量濃度為1.5～2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的生長速率最快，與Kommamine等[27]提出的細(xì)胞分裂素能提高原胚團(tuán)的生長速率吻合.從17組培養(yǎng)基(見表1)中，筆者選出最佳誘導(dǎo)激素配比為1.0 mg/L 2,4-D，4.0 mg/L NAA和2.0 mg/L KT.

秈稻組培體系中，愈傷組織的分化一直是一道難題.筆者通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)優(yōu)化了“成恢448”愈傷組織的分化條件，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，NAA，KT和6-BA對(duì)于愈傷組織的分化率不呈線性關(guān)系，這可能與各激素在分化過程中復(fù)雜的作用機(jī)制有關(guān).愈傷組織分化過程中生長素的濃度比誘導(dǎo)過程中的低得多，只在0.25～1.00 mg/L之間，顯然，低濃度的生長素有利于“成恢448”愈傷組織的分化，這和其他植物愈傷組織的分化[28]是相通的.與許多報(bào)道相一致的是，KT和6-BA能夠在一定程度上拮抗高濃度2,4-D對(duì)愈傷組織分化的抑制作用，有利于水稻愈傷組織的分化[28-30].目前對(duì)蜀恢881，IR24和93-11等數(shù)個(gè)秈稻品種已報(bào)道了不同的再生體系[31-32],雖然針對(duì)不同品種其添加的激素濃度不同，但NAA，KT或6-BA不可或缺，可知植物生長素和細(xì)胞分裂素對(duì)于愈傷組織的再生起到不可忽視的作用.

本文建立了秈稻“成恢448”的組培體系，這一結(jié)果為該強(qiáng)優(yōu)恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因抗病育種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為水稻抗白葉枯病基因的克隆與功能研究提供了一個(gè)有效的轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證受體系統(tǒng).

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