虎杖根莖超臨界CO2萃取物GC/MS分析及抗細胞遷移活性評價

李武國，劉嘉煒，李慶國，葉玉珊，司馬貞華

(1. 廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

虎杖為蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根莖，具有散瘀定痛、祛風利濕、止咳化痰之功效。在傳統(tǒng)醫(yī)學中，主要用于咳嗽痰多、關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、癰腫瘡毒和癓瘕等病癥[1]；現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖具有抗流感病毒、抗艾滋病毒、抗菌、抗腫瘤和抗炎癥等藥理作用[2]。利用傳統(tǒng)植物化學手段對虎杖化學成分進行研究表明，其根莖部位主要含有聯(lián)苯乙烯類、醌類和黃酮類等化學成分[3-4]，其中，對聯(lián)苯乙烯類白藜蘆醇衍生物和蒽醌類衍生物的提取分離研究較為深入，其萃取方法有溶劑萃取、超聲波輔助萃取和微波輔助萃取等[5-6]；利用水蒸氣蒸餾法提取虎杖揮發(fā)油的GC/MS分析結(jié)果表明，其根莖部位還含有噻吩類、菲類、萘類和聯(lián)苯類等揮發(fā)性化學成分[7]；但利用超臨界CO2萃取虎杖根莖揮發(fā)性化學成分，并采用GC/MS法對其進行分析還未見報道。與傳統(tǒng)的萃取方法(如水蒸氣蒸餾、有機溶劑萃取等)相比，超臨界CO2萃取是一種新型的現(xiàn)代“綠色分離”技術(shù)，具有無溶劑殘留、無熱分解破壞、對揮發(fā)性小分子化合物的提取效率高等優(yōu)點[8]。

近年來，本課題組利用植物化學研究方法對虎杖根莖活性化學成分進行了深入研究，基于藥理活性導(dǎo)向法從虎杖提取物中分離鑒定出一組H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑[3]和新型IL-6/STAT3信號通路抑制劑[9]。這為植物來源靶向抗流感病毒和抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了結(jié)構(gòu)信息和參考，同時還發(fā)現(xiàn)該藥材乙酸乙酯提取物含有一些低極性化合物，其成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)相似，利用傳統(tǒng)植物化學方法難以純化分離獲得單體化合物來進行結(jié)構(gòu)鑒定。為了從不同角度探討虎杖根莖部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)對其根莖粉末進行萃取，對萃取物進行GC/MS分離分析，并利用體外傷口愈合模型評價其抗細胞遷移活性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

HA121-50-05型超臨界流體萃取儀：江蘇華安科研儀器有限公司產(chǎn)品；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；Voyager型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品，配有NIST05質(zhì)譜檢索庫；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；CKX41型相差倒置顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品；TC10型細胞計數(shù)儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

虎杖藥材(批號：091101)：購自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定教研室彭光天博士鑒定；人肝癌細胞株Huh-7：由鄭州大學醫(yī)藥科學研究院提供；二氧化碳(純度99.9%)、氦氣(純度99.99%)、95%乙醇、無水硫酸鈉、DMSO、乙醚及其他試劑均為分析純；DMEM培養(yǎng)液(C11995)、PBS緩沖液(C10010)、胎牛血清(10099)、0.25% Trypsin-EDTA(25200)、Pen Strep(15140)：均為美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1虎杖根莖超臨界CO2萃取物的萃取

取2 kg粉碎后的虎杖根莖，過50目篩，裝入超臨界萃取釜中，萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為45 ℃，加入一定量95%乙醇作為夾帶劑，萃取時間為2 h。其中，分離釜I的溫度為45 ℃，壓力為5.4 MPa；分離釜II的溫度為50 ℃，壓力為5.4 MPa。

1.3.2樣品處理 超臨界萃取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收夾帶劑乙醇，取適量浸膏，用乙醚配制成50 g/L溶液，加適量無水Na2SO4，脫水干燥，過0.45 μm微孔濾膜，將濾液進行GC/MS分析。

1.3.3氣相色譜條件 TG WAXMS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；進樣口溫度220 ℃；載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，恒流模式；分流進樣，分流比30∶1，進樣量1 μL。

1.3.4質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃，接口溫度230 ℃；電離方式為電子轟擊(EI)源，電子轟擊能量70 eV；全掃描模式，掃描速度1 975.50 u/s，掃描范圍m/z35～600；溶劑延遲時間3 min。

1.3.5相對百分含量的計算 各化學成分通過NIST Search2.0標準質(zhì)譜圖庫進行檢索匹配，并人工解析質(zhì)譜，以確證化合物的結(jié)構(gòu)；采用峰面積歸一法計算分離鑒定化學成分的相對百分含量。

1.3.6體外細胞遷移測試(傷口愈合模型)[10]

體外培養(yǎng)人來源的肝癌Huh-7細胞株，Huh-7細胞生長至約80%融合時，收集對數(shù)生長期的Huh-7細胞，胰酶消化后計數(shù)，在6孔板中每孔加入約106個細胞，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞接種于6孔板24 h后，吸取各孔中的培養(yǎng)液，用200 μL移液槍頭垂直于背后的橫線劃痕，造成傷口愈合細胞遷移模型，無鈣PBS沖洗細胞表面3次以去除細胞殘骸和碎片。空白對照組每孔加入2.5 mL 含0.1% DMSO和2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，給藥組每孔加入2.5 mL 含2% FBS和不同濃度(1、5、10 mg/L)虎杖萃取物的DMEM培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，0、24、48 h分別在倒置顯微鏡下拍照，并用image j計算遷移面積。采用SPSS11.0軟件對各組細胞遷移數(shù)進行統(tǒng)計，并對結(jié)果進行單因素方差分析。

1.3.7體外細胞毒性測試[11]體外培養(yǎng)人肝癌Huh-7 細胞株，細胞生長至約80% 融合時，收集對數(shù)生長期的Huh-7細胞，消化后計數(shù)，在96孔板中每孔加入約104個細胞，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞接種于96孔板24 h后，吸取各孔中的培養(yǎng)液，空白對照組每孔加入200 μL含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，給藥組每孔加入200 μL含10% FBS和不同濃度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)虎杖

根莖超臨界CO2萃取物的DMEM培養(yǎng)液，每組平行設(shè)置3個孔，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。用酶標儀490 nm測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果

2.1.1超臨界CO2萃取及GC/MS分析 在本實驗條件下，2 kg虎杖根莖藥材粉末經(jīng)超臨界CO2流體萃取，得到4.8 g浸膏，得率為0.24%；對萃取物進行GC/MS分析，得到的總離子流圖示于圖1。在虎杖根莖超臨界CO2萃取物總離子流圖中，共分離獲得65個化學組分峰，其中鑒定確證33個化合物，占總檢測到化學成分相對百分含量的93.6%，詳情列于表1。含量較高的化合物是2,3-丁二醇、吉瑪烯B、醋酸、丙二醇和莪術(shù)烯等，分別占5.9%、6.5%、6.9%、12.2%和41.8%，其中莪術(shù)烯含量最高，是虎杖超臨界CO2萃取物的主要化學成分之一。

2.1.2體外人肝癌Huh-7 細胞遷移和細胞毒活性測試 虎杖根莖超臨界CO2萃取物對體外傷口愈合模型Huh-7細胞遷移測試實驗的結(jié)果示于圖2a和2b。與空白組比較，在濃度為1 mg/L和5 mg/L時，虎杖根莖超臨界CO2萃取物對人肝癌細胞Huh-7的細胞遷移活性均沒有明顯抑制效果，但在濃度為10 mg/L作用24 h時，能較顯著地抑制人肝癌細胞Huh-7的細胞遷移活性，抑制率為19.85%(p<0.01)。為了進一步驗證虎杖根莖超臨界CO2萃取物抑制細胞遷移活性與其細胞毒活性的關(guān)系，用不同濃度(0、1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L)萃取物分別處理人肝癌Huh-7細胞 24 h。MTT法測試表明，虎杖根莖萃取物在濃度為10 mg/L和20 mg/L時，對人肝癌Huh-7細胞的細胞增殖和細胞存活沒有影響；萃取物在濃度為20 mg/L以下時，沒有表現(xiàn)出細胞毒性；但在濃度大于 40 mg/L時，對細胞增殖表現(xiàn)出抑制效果，其IC50= 38.6 mg/L，示于圖2c。可見，虎杖根莖超臨界CO2萃取物在濃度為10 mg/L時，抑制Huh-7細胞遷移的生物機制與其細胞毒活性無直接相關(guān)。

圖1 虎杖根莖SFE-CO2萃取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the SFE-CO2 extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum

峰號保留時間/min化合物名稱分子式相對分子質(zhì)量匹配度/%質(zhì)量百分數(shù)/%18.0 3-甲基-2-丁醇3-Methyl-2-butanol C5H12O8879.10.5 210.0 羥基丁酮Acetoin C4H8O28887.10.6 314.5 醋酸Acetic acid C2H4O26088.76.9 415.3 古巴烯Copaene C15H2420491.30.3 516.0 β-綠葉烯β-Patchoulene C15H2420480.70.1 616.1 α-古蕓烯α-Gurjunene C15H2420480.70.2 716.3 δ-新丁香三環(huán)烯δ-Neoclovene C15H2420473.30.4 816.4 丙二醇Propylene glycol C3H8O27672.112.2 917.4 異丁子香烯IsocaryophilleneC15H2420482.80.3 1017.6 2,3-丁二醇2,3-Butanediol C4H10O29092.15.9 1117.9 丁子香烯Caryophyllene C15H2420494.00.7 1218.9 甘香烯Elixene C15H2420489.80.3 1319.6 α-石竹烯α-Caryophyllene C15H2420492.40.4 1420.1 β-雪松烯β-Himachalene C15H2420483.30.1 1520.8 β-桉葉烯β-Eudesmene C15H2420492.61.7 1620.8 α-姜烯α-Zingiberene C15H2420484.30.1 1720.9 α-衣蘭油烯α-Muurolene C15H2420485.40.1 1821.1 雅欖藍烯EremophileneC15H2420484.00.2 1921.7 δ-蓽澄茄烯δ-Cadinene C15H2420484.70.1 2022.0 β-倍半水芹烯β-Sesquiphellandrene C15H2420489.20.2

續(xù)表

峰號保留時間/min化合物名稱分子式相對分子質(zhì)量匹配度/%質(zhì)量百分數(shù)/%2122.1 β-人參烯β-Panasinsene C15H2420488.05.8 2222.6 γ-欖香烯γ-Elemene C15H2420487.60.8 2323.2 吉瑪烯B Germacrene B C15H2420486.16.5 2423.9 脫氫香橙烯Dehydro-aromadendrene C15H2220282.40.5 2524.59,10-脫氫異長葉烯9,10-Dehydro-isolongifolene C15H2220286.10.72627.7 反式桂皮醛 (E)-Cinnamaldehyde C9H8O13290.00.1 2729.3 莪術(shù)烯Curzerene C15H20O21678.741.8 2832.5 長馬鞭草烯酮Longiverbenone C15H22O21882.10.9 2933.7 (-)-斯巴醇 (-)-Spathulenol C15H24O22079.70.1 3035.24,5-脫氫異長葉烯4,5-Dehydro-isolongifolene C15H2220280.82.63137.12-(4a,8-二甲基-2,3,4,4a,5,6-六氫化-奈-2-基)-丙烯-2-乙二胺-1-醇2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6-hexahydro-naphthalen-2-yl)-prop-2-en-1-ol C15H22O21877.90.43242.1 n-棕櫚酸n-Hexadecanoic acid C16H32O225680.20.5 3343.38,9-脫氫-9-甲酰基-環(huán)異長葉烯8,9-Dehydro-9-formyl-cycloisolongifolene C16H22O23076.61.8

注：a.b.體外傷口愈合模型評價虎杖根莖SFE-CO2萃取物對人肝癌細胞Huh-7的抑制細胞遷移活性(*p<0.05, 與48 h空白比較，**p<0.01, 與24 h空白比較)； c.MTT法評價SFE-CO2萃取物的細胞毒活性圖2 虎杖根莖SFE-CO2萃取物對人肝癌Huh-7 細胞遷移和細胞毒活性的作用結(jié)果Fig.2 Anti-migration and cytotoxic effects of the supercritical extracts from the rhizomes of Polygonum cuspidatum towards human hepatoma Huh-7 cells

2.2 討論

本研究采用超臨界CO2萃取虎杖根莖的低極性成分，經(jīng)GC/MS分析，共分離獲得65個化學組分峰，并鑒定了其中33種化合物，主要成分為莪術(shù)烯、丙二醇、醋酸、吉瑪烯B和2,3-丁二醇等化合物。與文獻[7]相比，本研究的方法能獲得更多的化學成分，而且在主要化學成分的種類上也有很大差異。

體外傷口愈合模型測試表明，虎杖超臨界CO2萃取物在濃度為10 mg/L作用24 h和48 h時，均能較顯著地抑制人肝癌細胞Huh-7的細胞遷移活性；MTT法測試表明，虎杖超臨界CO2萃取物在濃度低于20 mg/L時，對Huh-7細胞的增殖和存活無抑制作用，其體外細胞毒活性IC50為38.6 mg/L。因此，虎杖萃取物抑制細胞遷移的生物活性機制與其細胞毒性無直接相關(guān)，其生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)可能是萃取物中含量較高的化學成分，如莪術(shù)烯等。本實驗中，莪術(shù)烯是虎杖超臨界CO2萃取物相對百分含量較高的成分，占萃取物的 41.8%，因此，莪術(shù)烯很可能是虎杖超臨界CO2萃取物中抑制人肝癌Huh-7細胞遷移活性的主要成分之一。莪術(shù)烯是呋喃二烯結(jié)構(gòu)化合物[12]，該化合物能通過PI3K 信號途徑下調(diào)細胞內(nèi)p-Akt, p-Erk 1/2, ICAM-1, p-p85和 p85的蛋白表達水平，從而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲和血管形成[13]，還能通過MAPK等信號途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和腫瘤侵襲[14-16]。另外，莪術(shù)烯也是很多植物揮發(fā)油的主要成分之一，如莪術(shù)[17]、紅果子[18]和Benitez[19]等?，F(xiàn)代藥理學研究表明，莪術(shù)烯對 THP-l 細胞分泌TNFα炎癥因子有明顯的抑制作用[20]，對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞釋放NO表現(xiàn)出顯著的抑制活性, IC50為9.4 μmol/L[21]。據(jù)此推測，莪術(shù)烯可能是虎杖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，值得進一步深入研究。

3 結(jié)論

利用超臨界CO2萃取技術(shù)對虎杖根莖粉末進行萃取，并對萃取物進行GC/MS分離分析，得到65個化學組分峰，鑒定了其中的33個化合物，主要成分為莪術(shù)烯，進一步測試表明，虎杖根莖超臨界CO2萃取物的非細胞毒劑量對人肝癌細胞Huh-7的細胞遷移活性具有抑制效果。

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