皮質(zhì)醇純物質(zhì)中雜質(zhì)分析與定值

王孜一，戴新華，張 偉，李紅梅，王紹利，許 靚

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013；2. 江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)儀器計(jì)量中心，江蘇 常州 213164)

皮質(zhì)醇(hydrocortisone，HC)的化學(xué)名稱是11β,17α,21-三羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮，屬于甾體類化合物，其結(jié)構(gòu)示于圖1。皮質(zhì)醇是腎上腺皮質(zhì)激素的一種，也是主要的應(yīng)激性激素，在腦垂體分泌的促皮質(zhì)素(ACTH)的調(diào)節(jié)下，由腎上腺束狀帶合成、分泌，是人體最主要的、內(nèi)源性的、具有生物活性的糖皮質(zhì)激素。

圖1 皮質(zhì)醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structural of hydrocortisone

皮質(zhì)醇的合成方法分為全合成法和半合成法。全合成法即全化學(xué)合成法，步驟多、轉(zhuǎn)化率

低[1-4]、價(jià)格昂貴。目前生產(chǎn)的皮質(zhì)醇幾乎全部采用半合成法，以含甾體母核的生物質(zhì)作為原料[5-10]，其中薯蕷皂素是使用最為廣泛的生產(chǎn)原料。薯蕷皂素經(jīng)開環(huán)裂解去掉E、F環(huán)后，能獲得理想的HC關(guān)鍵中間體——雙烯醇酮醋酸酯；將雙烯醇酮醋酸酯C3羥基轉(zhuǎn)化為羰基，C5、C6雙鍵移至C4、C5位，再引入C11、C17、C21三個(gè)位置的羥基，可得到HC，其流程圖示于圖2。

在當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)研究中，測(cè)定皮質(zhì)醇的水平是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。皮質(zhì)醇不僅對(duì)調(diào)節(jié)人體的脂肪和蛋白質(zhì)的代謝有重要作用，對(duì)免疫系統(tǒng)和其他內(nèi)分泌系統(tǒng)也有影響。激素類純物質(zhì)中結(jié)構(gòu)類似物較多，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和定量測(cè)定難度大，這是臨床檢驗(yàn)量值溯源亟待解決的問題。本工作將對(duì)皮質(zhì)醇純品中的雜質(zhì)進(jìn)行定性定量以及純度測(cè)量，旨為激素類及其他有機(jī)純物質(zhì)的定性和定量提供方法參考。

圖2 皮質(zhì)醇制備流程圖Fig.2 Flow Chart of hydrocortisone fabrication

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-IT-TOF)，液相色譜二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)：日本島津公司產(chǎn)品；Agilent 6410 QQQ三重四極桿質(zhì)譜儀，Agilent 6890N氣相色譜儀，Agilent G1888頂空進(jìn)樣器：美國Agilent公司產(chǎn)品；XP205電子天平(最小分度值0.01 mg)，UMX2電子天平(最小分度值0.1 μg)，DL-39卡爾費(fèi)休庫侖法水分測(cè)定儀：瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；TGA-1熱重分析儀：美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)：美國Thermo公司產(chǎn)品；Bruker AVANCE IIITM 800核磁共振儀：德國Burker公司產(chǎn)品，配四共振超低溫探頭。

皮質(zhì)醇純品(標(biāo)示純度99.5%)，醋酸氫化可的松純品(標(biāo)示純度99.5%)：德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；可的松純品(標(biāo)示純度98%)：美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈，甲醇(色譜級(jí))：德國Merck公司產(chǎn)品；氘代丙酮：北京漢威士波譜公司產(chǎn)品；尼泊金乙酯(GBW(E)100064)：由中國計(jì)量科學(xué)研究院提供；高純?nèi)嗡?，過0.22 μm濾膜。

1.2 樣品制備

皮質(zhì)醇純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物為德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，初步分析純度達(dá)99%以上。將其分裝至棕色玻璃瓶中，單元數(shù)為300瓶，每瓶約100 mg，避光密封，于-20 ℃下保存，作為皮質(zhì)醇純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原料。

1.3 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

待測(cè)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用重量法配制，以甲醇為溶劑，所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液均于4 ℃下熔融，密封保存于棕色安瓿瓶中。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1HPLC-IT-TOF條件 色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×3.5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；流速0.2 mL/min；等度洗脫(A/B=58/42)，洗脫時(shí)間90 min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子方式；掃描范圍m/z50～500；離子源溫度200 ℃；曲型脫溶劑管溫度200 ℃；霧化氣流速(N2)1.5 L/min；檢測(cè)器電壓1.58 kV；碰撞能量：50%，70%；碰撞氣流速(Ar)45 mL/min。

1.4.2HPLC-MS/MS條件 色譜條件同HPLC-IT-TOF。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子方式；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速9 L/min；霧化器壓力2.76×105Pa；毛細(xì)管電壓3 500 V。碎裂電壓、SIM離子采集參數(shù)列于表1。

表1 不同化合物的掃描模式、碎裂電壓和母離子

1.4.3頂空進(jìn)樣及色譜條件 頂空進(jìn)樣條件：頂空進(jìn)樣瓶體積10 mL，爐溫60 ℃，定量圈溫度80 ℃，傳輸線溫度100 ℃，平衡時(shí)間20 min。

氣相色譜條件：DB-624色譜柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm)；進(jìn)樣口溫度150 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；進(jìn)樣體積100 μL；分流比為5∶1；載氣(N2)流速1.4 mL/min；升溫程序：初始溫度為45 ℃，保持5 min，以7 ℃/min升至120 ℃，然后以15 ℃/min升至220 ℃，保持8 min。

1.5 定性分析

采用HPLC-IT-TOF法對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，借助質(zhì)譜儀的高分辨率和精確質(zhì)量數(shù)優(yōu)勢(shì)，由雜質(zhì)化合物各級(jí)質(zhì)譜碎片的測(cè)量值、化學(xué)式和理論值，推測(cè)雜質(zhì)的分子式和結(jié)構(gòu)。

1.6 定量分析

采用液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)外標(biāo)單點(diǎn)法對(duì)皮質(zhì)醇純品中與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，并采用卡爾費(fèi)休庫侖法測(cè)定皮質(zhì)醇純品中的水含量，頂空-氣相色譜法測(cè)定皮質(zhì)醇純品中揮發(fā)性雜質(zhì)含量，電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定無機(jī)元素。

2 結(jié)果與討論

2.1 皮質(zhì)醇純品中與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)定性

近年來各種串聯(lián)質(zhì)譜得到了廣泛應(yīng)用，如三重四極桿質(zhì)譜、四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜、離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜等。其中，離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜既具備高分辨率和高準(zhǔn)確度，又具備多級(jí)質(zhì)譜功能(最多到10級(jí))，因此對(duì)化合物分子式的預(yù)測(cè)能力強(qiáng)，對(duì)復(fù)雜裂解規(guī)律的推導(dǎo)準(zhǔn)確性高，特別適合同時(shí)對(duì)多種微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量的分析[11-14]。

皮質(zhì)醇純品中主成分和雜質(zhì)分離的液相色譜圖和總離子流圖分別示于圖3、圖4。

從兩張圖的對(duì)比可見，雜質(zhì)1、2、3、4的含量較高，根據(jù)圖3中歸一化結(jié)果分析，雜質(zhì)1、3、4的含量都大于或等于千分之一，圖4中雜質(zhì)2的含量也較高，通常在純物質(zhì)的定值方法中，大于千分之一的雜質(zhì)需要分別定值，因此，需要對(duì)雜質(zhì)1、2、3、4分別定值。根據(jù)質(zhì)量平衡法，含量小于千分之一的雜質(zhì)對(duì)最終純物質(zhì)的純度值影響很小，一般可以忽略。圖3中，雜質(zhì)3、4之間的兩個(gè)峰在歸一化計(jì)算的結(jié)果中均小于千分之一，而且在圖4中的響應(yīng)也很小，含量較小，可忽略不計(jì)。

圖3 皮質(zhì)醇純品中主成分和雜質(zhì)分離的液相色譜圖 Fig.3 Chromatogram of main component and impurities in hydrocortisone

圖4 皮質(zhì)醇純品中主成分和雜質(zhì)分離的總離子流色譜圖 Fig.4 TIC diagram of main component and impurities in hydrocortisone

為了能夠準(zhǔn)確定值，先對(duì)需要定值的4種雜質(zhì)進(jìn)行定性分析。通過HPLC-IT-TOF獲得4種雜質(zhì)的母離子及精確分子質(zhì)量。參照文獻(xiàn)[15]，并結(jié)合所測(cè)定的4種雜質(zhì)的精確分子質(zhì)量，初步認(rèn)定，雜質(zhì)1為可的松，雜質(zhì)2為可的松的異構(gòu)體，雜質(zhì)3未知，但是一種與皮質(zhì)醇結(jié)構(gòu)類似的激素，雜質(zhì)4為醋酸氫化可的松。

向皮質(zhì)醇樣品中加入可的松和醋酸氫化可的松樣品，用HPLC進(jìn)行測(cè)試，通過保留時(shí)間來驗(yàn)證雜質(zhì)1、4是否為可的松和醋酸氫化可的松，結(jié)果示于圖5和圖6。與圖3相比較，雜質(zhì)1和雜質(zhì)4的峰高明顯增加，但保留時(shí)間完全一致，從而可以確定雜質(zhì)1與雜質(zhì)4分別為可的松和醋酸氫化可的松。

采用HPLC-IT-TOF法對(duì)樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定和1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)碎片分析，并預(yù)測(cè)其分子式，結(jié)果列于表2。然后再采用HPLC-IT-TOF法對(duì)可的松、醋酸氫化可的松的純品進(jìn)行1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)碎片分析，得到雜質(zhì)及純品的分子式和碎片信息，并根據(jù)精確分子質(zhì)量和碎片離子質(zhì)荷比進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)，結(jié)果列于表3。

圖5 添加可的松的皮質(zhì)醇樣品液相色譜圖 Fig.5 Chromatogram of hydrocortisone with addition of cortisone

圖6 添加醋酸氫化可的松的皮質(zhì)醇樣品液相色譜圖 Fig.6 Chromatogram of hydrocortisone with addition of hydrocortisone acetate

通過比較樣品中雜質(zhì)及純品的保留時(shí)間、分子質(zhì)量、預(yù)測(cè)分子式及碎片信息，表明雜質(zhì)1與可

的松完全一致，雜質(zhì)4與醋酸氫化可的松完全一致。雜質(zhì)2的分子質(zhì)量以及預(yù)測(cè)分子式與可的松相同，結(jié)合相關(guān)報(bào)道[16]初步預(yù)測(cè)雜質(zhì)2可能是潑尼松龍，但雜質(zhì)2與潑尼松龍的保留時(shí)間不一致，說明雜質(zhì)2不是潑尼松龍。雜質(zhì)3的預(yù)測(cè)分子式為C19H26O3，根據(jù)皮質(zhì)醇合成路線，可能為甲睪酮，但雜質(zhì)3與甲睪酮的保留時(shí)間不一致，說明雜質(zhì)3不是甲睪酮。

2.2 皮質(zhì)醇純品中雜質(zhì)的定量

2.2.1與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)定量 與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)用HPLC-MS/MS單點(diǎn)外標(biāo)法測(cè)定含量，計(jì)算公式為：

(1)

式中，mim為皮質(zhì)醇中雜質(zhì)的質(zhì)量；mc為皮質(zhì)醇樣品的質(zhì)量；Aim為皮質(zhì)醇樣品溶液中雜質(zhì)的峰面積；Astd為雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；cstd為雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；cim為皮質(zhì)醇樣品的濃度；Ps為配制雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所用純品的純度。

表2 4種雜質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)及三級(jí)碎片，離子精確質(zhì)量數(shù)和預(yù)測(cè)分子式

表3 可的松、醋酸氫化可的松的一級(jí)、二級(jí)及三級(jí)碎片，離子精確質(zhì)量數(shù)和預(yù)測(cè)分子式

其中，雜質(zhì)1和 4已經(jīng)定性，可選取相應(yīng)純品作為標(biāo)準(zhǔn)；雜質(zhì)2和3未最終確定，但從碎片信息中可以推斷出，雜質(zhì)2是一種分子式與可的松相同，且結(jié)構(gòu)類似的甾體類化合物，即可的松的異構(gòu)體，而雜質(zhì)3也是一種甾體類化合物，因此可以選取結(jié)構(gòu)類似的化合物純品作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。初步選定可的松和皮質(zhì)醇作為標(biāo)準(zhǔn)替代物，分別采用HPLC-MS/MS和HPLC-UV兩種方法對(duì)雜質(zhì)2和3的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，用皮質(zhì)醇作為標(biāo)準(zhǔn)替代物測(cè)得的結(jié)果略高，兩種方法的定量結(jié)果偏差僅為0.1%。根據(jù)測(cè)量結(jié)果可適當(dāng)放大不確定度的原則，最終使用HPLC-MS/MS方法，同時(shí)采用皮質(zhì)醇作為標(biāo)準(zhǔn)替代物對(duì)雜質(zhì)2和3進(jìn)行定值。4種雜質(zhì)的測(cè)量結(jié)果列于表4。

表4 皮質(zhì)醇中與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果

2.2.2水分及揮發(fā)性雜質(zhì)定量 樣品中水分含量由卡爾費(fèi)休庫侖法水分測(cè)定儀測(cè)量，結(jié)果列于表5。揮發(fā)性雜質(zhì)主要是揮發(fā)性有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、乙腈、甲苯殘留，含量由頂空氣相色譜法測(cè)定，皮質(zhì)醇純品制備時(shí)，大部分揮發(fā)性物質(zhì)已被除去，測(cè)量結(jié)果小于0.01%(100 μg/g)。

2.2.3不揮發(fā)性雜質(zhì)定量 采用ICP-MS法對(duì)樣品中不揮發(fā)性雜質(zhì)進(jìn)行分析，得到無機(jī)類雜質(zhì)的總含量為0.008 9%。

2.3 皮質(zhì)醇純度定值及不確定度計(jì)算

2.3.1純度定值 目前國際上對(duì)有機(jī)純物質(zhì)的定值大多采用質(zhì)量平衡法[17]，這種方法的定值準(zhǔn)確度高，計(jì)算公式為：

WA=100%-(WRS+WW+WOS+WNV)

(2)

式中，WA為待測(cè)樣品純度；WRS為與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)含量；WW為水分含量；WOS為揮發(fā)性雜質(zhì)含量；WNV為不揮發(fā)性雜質(zhì)含量。

計(jì)算得到皮質(zhì)醇純度值為99.18%。

采用定量核磁法對(duì)定值結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以尼泊金乙酯為內(nèi)標(biāo)，核磁定量結(jié)果列于表6。

表5 皮質(zhì)醇中水分含量測(cè)定結(jié)果

表6 皮質(zhì)醇核磁定量結(jié)果

質(zhì)量平衡法與核磁法定量結(jié)果的相對(duì)偏差僅為0.09%,說明質(zhì)量平衡法定值結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.3.2不確定度計(jì)算 皮質(zhì)醇純度定值的不確定度是由每類雜質(zhì)所引入的不確定度合成而來[18]，其計(jì)算公式為[19]：

u(WA)=

(3)

式中，u(WA)為皮質(zhì)醇純度測(cè)定值的合成不確定度；u(WRS)為與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)所引入的不確定度；u(WW)為水分引入的不確定度；u(WOS)為揮發(fā)性雜質(zhì)引入的不確定度；u(WNV)為不揮發(fā)性雜質(zhì)引入的不確定度。

質(zhì)量平衡法計(jì)算得到皮質(zhì)醇定值的合成不確定度為0.09%，擴(kuò)展不確定度為0.18%(k=2,置信度為95%)。

3 結(jié)論

本工作采用HPLC-IT-TOF法對(duì)皮質(zhì)醇純品中與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定和分析，建立了有機(jī)純物質(zhì)中與主成分結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)的定性方法。采用HPLC-MS/MS外標(biāo)法對(duì)與主成分結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)進(jìn)行了定量分析，并采用卡爾費(fèi)休庫侖法、頂空-氣相色譜法以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)水分、揮發(fā)性雜質(zhì)以及不揮發(fā)性雜質(zhì)的含量進(jìn)行了測(cè)定，通過質(zhì)量平衡法計(jì)算皮質(zhì)醇純品的純度值，同時(shí)采用定量核磁進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，兩種方法定值結(jié)果的一致性較好，說明所建立的定性及定量方法準(zhǔn)確可靠，對(duì)激素類及其他有機(jī)純物質(zhì)的定性和定量有較好的指導(dǎo)作用。

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