稀苯扎溴銨溶液微生物限度檢查方法的建立及方法學(xué)驗(yàn)證

張國(guó)慶，杜建紅，祝 輝，劉 徽，方 晨 (成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，四川 成都 610017)

稀苯扎溴銨溶液為2002年版《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》所收載的外用非滅菌溶液劑，具有消毒、防腐作用，用于皮膚消毒。由于2002年版《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[2]未給出確切的微生物限度檢查方法，而2005年版之前的《中國(guó)藥典》對(duì)微生物限度檢查法也未規(guī)定對(duì)檢驗(yàn)方法的適用性進(jìn)行驗(yàn)證，不能確保在該檢驗(yàn)條件下的樣品濃度是否足以抑制污染微生物的生長(zhǎng)，使供試品中污染的微生物得以真實(shí)的反映，從而保證結(jié)果的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。因此，依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版[1]二部的附錄XI J《微生物限度檢查法》中方法驗(yàn)證試驗(yàn)的要求，同時(shí)參照文獻(xiàn)[3～6]對(duì)本品建立微生物限度檢查方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確保方法的有效性。

1 儀器與材料

1.1儀器 BSC-1000IIA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); LDZH高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠); DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); SHH 250 L生化培養(yǎng)箱(重慶四達(dá)試驗(yàn)儀器有限公司); DKB8A電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); HTY601集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司); GDHD-4電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(廈門醫(yī)療電子儀器廠)。

1.2材料 稀苯扎溴銨溶液(批號(hào):20130901, 20130902, 20130903，解放軍452醫(yī)院配制)。0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液原料藥(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20120411)，后自行配制。0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)，批號(hào)：M13082302)。pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)：1303112)，后按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。

1.3菌種 大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]均來源于成都市食品藥品生物制品檢定所，均為第3代培養(yǎng)物。

1.4培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基( 111222);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(1303262);營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(111207);改良馬丁培養(yǎng)基( 111214);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(121122);膽鹽乳糖培養(yǎng)基(1203192);甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(120419);溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(1109282);以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。

2 方法

2.1菌液制備 按《中國(guó)藥典》2010年版二部的附錄微生物限度檢查法進(jìn)行制備。取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用；取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加5 ml生理鹽水洗下孢子，吸出孢子懸液(用管口帶有薄紗布的無(wú)菌毛細(xì)吸管吸出胞子懸液)至無(wú)菌試管中，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU/ml的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2供試液制備 取本品10 ml，加pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，即得1:10供試液。

2.3回收率測(cè)定

2.3.1供試品對(duì)照組 采用薄膜過濾法測(cè)定供試品本底細(xì)菌數(shù)。加入50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤(rùn)濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，過濾。用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)。

采用薄膜過濾法測(cè)定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。方法同上，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)。

2.3.2菌液組 分別取上述大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌懸液1 ml，注入平皿，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.3試驗(yàn)組 采用薄膜過濾法測(cè)定細(xì)菌數(shù)。采用“2.3.1”方法，在最后一次的沖洗液中分別加入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)72 h。每種菌制備2張濾膜。采用薄膜過濾法測(cè)定霉菌和酵母菌數(shù)。方法同上，在最后一次的沖洗液中分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d(延至7 d)，每種菌制備2張濾膜。

2.3.4稀釋劑對(duì)照組 用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品。按試驗(yàn)組的方法和條件沖洗，在最后一次的沖洗液中分別加入各陽(yáng)性試驗(yàn)菌1 ml，混勻，過濾，測(cè)定其菌數(shù)。

2.3.5結(jié)果 各驗(yàn)證菌回收率測(cè)定結(jié)果見表1。

表2 微生物限度檢查(薄膜過濾法)各驗(yàn)證菌的回收率(n=3)

2.4控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1供試液制備 同“2.2”。

2.4.2銅綠假單胞菌檢查方法的驗(yàn)證(結(jié)果見表2)。

表2 銅綠假單胞菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4.2.1供試品對(duì)照組 加入50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤(rùn)濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，過濾。用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀察是否有典型菌落生長(zhǎng)。

2.4.2.2試驗(yàn)組 方法同供試品對(duì)照組，在最后一次的沖洗液中加入銅綠假單胞菌懸液1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀察是否有典型菌落生長(zhǎng)。

2.4.2.3陽(yáng)性對(duì)照組 取制備好的銅綠假單胞菌菌懸液1 ml加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

2.4.2.4陰性對(duì)照組 取制備好的大腸桿菌菌懸液1 ml加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況 。

2.4.3金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證(結(jié)果見表3)。

表3 金黃色葡萄球菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4.3.1供試品對(duì)照組 加入50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液過濾潤(rùn)濕濾膜，取供試液10 ml加至50 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，過濾。用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜4次，每次100 ml。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀察是否有典型菌落生長(zhǎng)。

2.4.3.2試驗(yàn)組 方法同供試品對(duì)照組，在最后一次的沖洗液中加入金黃色葡萄球菌懸液1 ml，混勻，過濾。最后用少量的沖洗液沖洗濾器內(nèi)壁。沖洗后取出濾膜，放入100 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，和陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀察是否有典型菌落生長(zhǎng)。

2.4.3.3陽(yáng)性對(duì)照組 取制備好的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml加入100 ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

2.4.3.4陰性對(duì)照組 取制備好的大腸桿菌菌懸液1 ml加入100 ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)22 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)22 h后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)果

3.1菌落計(jì)數(shù)驗(yàn)證結(jié)果 由表1可知，本品采用薄膜過濾法對(duì)細(xì)菌的人工染菌回收率進(jìn)行測(cè)定，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%；采用薄膜過濾法對(duì)霉菌和酵母菌數(shù)的人工染菌回收率進(jìn)行測(cè)定, 白色念珠菌、黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，同時(shí)，稀釋劑對(duì)照組的人工染菌回收率均高于70%。因此，本品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)的計(jì)數(shù)均可采用薄膜過濾法進(jìn)行測(cè)定(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

3.2控制菌檢查的驗(yàn)證結(jié)果 由表2可知，供試品對(duì)照組未檢出銅綠假單胞菌，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組均檢出銅綠假單胞菌，本品對(duì)銅綠假單胞菌的檢查采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

由表3可知，供試品對(duì)照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組均檢出金黃色葡萄球菌，本品對(duì)金黃色葡萄球菌的檢查采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)。

4 方法驗(yàn)證結(jié)論及標(biāo)準(zhǔn)修訂

本品可采用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，另可采用薄膜過濾法進(jìn)行控制菌的檢查。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果將微生物限度檢查方法記錄如下:

微生物限度 取本品10 ml，加pH 7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，得1:10供試液。細(xì)菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法(沖洗量:100 ml/次，沖洗4次) ，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法(沖洗量：100 ml/次，沖洗4次)，控制菌采用薄膜過濾法進(jìn)行檢查(培養(yǎng)基:100 ml;沖洗量:100 ml/次，沖洗4次)(中國(guó)藥典2010年版二部附錄Ⅺ J)，應(yīng)符合規(guī)定。

5 討論與建議

5.1在選用微生物限度驗(yàn)證方法時(shí)，有通用原則，即：“就簡(jiǎn)不就繁”。而筆者不能直接判定稀苯扎溴銨溶液對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌以及控制菌的抑菌程度，所以在采用薄膜過濾法之前，還考察了常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿 )，由于采用此二法則供試品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的人工染菌回收率低于70%。因此，本品細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)均應(yīng)重新選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，消除其抑菌活性后再進(jìn)行驗(yàn)證,并且控制菌也不能檢出。所以筆者選用薄膜過濾法。

5.2本品為2002年版《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》外用非滅菌溶液劑，可參照2010年版《中國(guó)藥典》中對(duì)洗劑或搽劑的檢查標(biāo)準(zhǔn)。由于在臨床上用于皮膚的消毒，因此建議微生物限度規(guī)定值比普通外用制劑的標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格，可以規(guī)定為細(xì)菌數(shù)應(yīng)不得過10 CFU/ml，霉菌和酵母菌數(shù)應(yīng)不得過10 CFU/ ml，每1毫升不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107-116.

[2] 解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范(2002年版)[S].人民軍醫(yī)出版社，2003：103-104，附錄67-80.

[3] 蘇德模,馬緒榮,許華玉，等. 藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].華齡出版社，2007：221-227.

[4] 曲 萍,仇麗霞,趙思俊,等.卡波姆抑菌凝膠劑微生物限度檢查方法的建立[J].藥物分析雜志, 2013,33(8):1317-1321.

[5] 應(yīng)國(guó)紅,鄧 穎,馮豐湊.外用制劑微生物限度檢查方法研究[J].中國(guó)藥業(yè),2008,17(21):32-33.

[6] 孟麗麗,陸 娟,李曉波,等.燒傷搽劑微生物限度檢查法的驗(yàn)證[J].中國(guó)藥師,2011,14(5):746-747.