植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

徐根娣，邵鄰相，吳旭峰，趙甘戩

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004;2.浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

植物細(xì)胞的培養(yǎng)在生物技術(shù)專業(yè)的許多課程中都有涉及.細(xì)胞工程是生物技術(shù)專業(yè)的重要專業(yè)必修課之一，實(shí)驗(yàn)課在整個(gè)課時(shí)中占有較大的比例，而植物細(xì)胞的培養(yǎng)自始至終都是這門課程的重要和關(guān)鍵的組成部分.除此之外，細(xì)胞生物學(xué)、植物體細(xì)胞遺傳學(xué)、遺傳學(xué)、基因工程下游技術(shù)、分子生物學(xué)、生化制藥技術(shù)、植物生物學(xué)和組織培養(yǎng)等課程的實(shí)驗(yàn)課都涉及到植物細(xì)胞的培養(yǎng)［1］，植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案的質(zhì)量直接影響著教學(xué)質(zhì)量的高低，也是提高學(xué)生動(dòng)手能力的關(guān)鍵所在.因此，有必要對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行研究和探索，以更好地應(yīng)用于細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)，為學(xué)生今后從事生物學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究，進(jìn)入與細(xì)胞工程有關(guān)的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)奠定必要的理論和技術(shù)基礎(chǔ)［2-3］.

利用植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)植物有用的代謝產(chǎn)物在近些年來(lái)取得了很大的發(fā)展［4-6］，但這些技術(shù)和方法往往實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)并且影響因素較多，對(duì)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)而言，由于學(xué)時(shí)的限制，植物細(xì)胞的培養(yǎng)不可能進(jìn)行全新的探索.因此，開(kāi)發(fā)適合本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的綜合實(shí)驗(yàn)，制訂具體化和可操作性的植物細(xì)胞培養(yǎng)方案，使生物技術(shù)專業(yè)的學(xué)生既能學(xué)到操作技術(shù)，培養(yǎng)其動(dòng)手能力，又能引導(dǎo)他們根據(jù)所學(xué)知識(shí)進(jìn)行切實(shí)可行的創(chuàng)新，提高其分析和解決問(wèn)題的能力.

1 植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施過(guò)程

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和材料準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)教師根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備、藥品、耗材等情況，提供大葉黃楊(Euonymus japonicus)、七子花(Hepatcodium miconioides)、紫花地丁(Viola philippica)、大豆(Glycine max)、牽?；?Pharbitis nil)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)、鳶尾(Iris bungei)、鴨趾草(Commelina communis)、一年蓬(Erigeron annuus)、北美車前(Plantago virginica)和加拿大一枝黃花(Solidago canadensis)等植物的嫩葉.學(xué)生根據(jù)自己的興趣自愿組合，3～4人為一小組，查閱文獻(xiàn)，寫出實(shí)驗(yàn)方案，內(nèi)容包括:實(shí)驗(yàn)意義和目的、實(shí)驗(yàn)材料和方法、實(shí)驗(yàn)植物種類、儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)步驟、預(yù)期結(jié)果等.經(jīng)全組同學(xué)討論后，最終確定選擇的植物材料為大葉黃楊、七子花、紫花地丁.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在老師的指導(dǎo)下，由每組學(xué)生分工協(xié)作獨(dú)立完成.實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:

1)愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

取大葉黃楊、七子花、紫花地丁的嫩葉，用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗一遍.在無(wú)菌條件下，用75%乙醇溶液浸漬30 s，再用1.5 g/L HgCl2溶液消毒5～8 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，用濾紙將多余水分吸干，然后將頂芽和側(cè)芽切成約1 cm的小段、葉片切成約0.5 cm2的小塊，接種于附加有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)或玉米素的瓊脂固化MS培養(yǎng)基(蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L，pH 5.8)上，置于(25±1)℃培養(yǎng)，以誘導(dǎo)愈傷組織.

2)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)

用鑷子夾取繼代4～5次生長(zhǎng)良好的疏松型胚性愈傷組織為材料進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，并將愈傷組織輕輕夾碎.在250 mL三角瓶中，加入約60 mL的MS液體培養(yǎng)基(蔗糖20 g/L，瓊脂6 g/L，pH 6.0)，分別附加有1，2 和3 mg/L 2，4-D 和0.4 mg/L 6-BA.每瓶接種1.5 ～2.0 g鮮愈傷組織，在100 r/min恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(28±1)℃.

3)細(xì)胞記數(shù)及形態(tài)觀察

取細(xì)胞懸液，加入2倍體積的80 g/L CrO3溶液，置于70℃水浴中處理15 min.冷卻后，用移液管重復(fù)吹打細(xì)胞懸液以使細(xì)胞分散，混勻后，取一滴懸液置于血細(xì)胞記數(shù)板上記數(shù).將培養(yǎng)有細(xì)胞懸液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡上，觀察并拍照.

2 植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施效果

實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中，除了教師的正確指導(dǎo)外，還要求學(xué)生進(jìn)行正確操作、仔細(xì)觀察和認(rèn)真分析.例如，在外植體消毒接種時(shí)，對(duì)無(wú)菌操作的要求非常高，一不小心，就可能污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗.有的學(xué)生很不耐煩，甚至想放棄，經(jīng)過(guò)教師的鼓勵(lì)，學(xué)生明白了科學(xué)實(shí)驗(yàn)是不斷探索的過(guò)程，期間會(huì)出現(xiàn)難以預(yù)料的情況，需要自己去解決.另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求以圖、表及照片的形式呈現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)須做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.由于各小組學(xué)生所選的實(shí)驗(yàn)材料不同，結(jié)果也有差異.

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)

1)大葉黃楊的葉片及芽接種后約12 d開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，且19 d后愈傷組織較為明顯，進(jìn)行第1次繼代，以后每隔10 d繼代一次.大葉黃楊愈傷組織培養(yǎng)前期的生長(zhǎng)速率較慢，繼代2次后愈傷組織生長(zhǎng)速率迅速加快，繼代4次后形成大量的質(zhì)地疏松、乳白色的愈傷組織.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的結(jié)果最為理想(見(jiàn)表1).

表1 不同濃度激素對(duì)植物幼葉愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2)七子花的葉片接種后第14 d開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，第1次轉(zhuǎn)接以后每隔10 d繼代一次.1次繼代后愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)依然很弱;經(jīng)過(guò)約3～4次繼代，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)逐漸好轉(zhuǎn)，愈傷組織團(tuán)增大;約繼代6次后，形成較大的愈傷組織團(tuán)，外觀呈致密的白色霜狀團(tuán)塊.1.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的誘導(dǎo)率可達(dá)74.0%(見(jiàn)表1).但在培養(yǎng)過(guò)程中外植體和愈傷組織均出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，并且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)褐變程度逐漸加深.

3)紫花地丁愈傷組織的誘導(dǎo)周期為10 d，每12 d繼代一次.所得愈傷組織為淡黃綠色顆粒，質(zhì)地較致密，且生長(zhǎng)狀況良好.其中，以2.0 mg/L 2，4-D和0.4 mg/L 6-BA共同處理的結(jié)果最為理想(見(jiàn)表1).

2.2 植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)

1)取繼代4次的大葉黃楊乳白色疏松愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng).發(fā)現(xiàn):初期細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較慢，1周后仍未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯增殖;繼續(xù)培養(yǎng)2周后細(xì)胞增殖顯著，此時(shí)可觀察到形態(tài)清晰的單細(xì)胞(見(jiàn)圖1中A)、細(xì)胞團(tuán)(見(jiàn)圖1中B)及變形細(xì)胞(見(jiàn)圖1中C)，細(xì)胞記數(shù)結(jié)果為2.46×103個(gè)/mL.每3 d記數(shù)1次，所得的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖2所示.培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)輕度的褐變，且隨培養(yǎng)的進(jìn)行，褐變程度有逐漸加深的趨勢(shì).但細(xì)胞分裂繼續(xù)旺盛進(jìn)行，培養(yǎng)21 d后，懸液呈現(xiàn)淺褐色.

2)將經(jīng)過(guò)3次繼代的七子花愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，此時(shí)的愈傷組織較致密，因此需在懸浮培養(yǎng)前先將愈傷組織用鑷子夾碎.2周后進(jìn)行細(xì)胞觀察，七子花懸浮培養(yǎng)所得的變形長(zhǎng)細(xì)胞頂端有月牙狀勾起，與其他植物變形細(xì)胞的差異明顯(見(jiàn)圖1中D).比較而言，七子花的細(xì)胞增殖速度較大葉黃楊緩慢，且變形細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞的集群性也更為明顯(見(jiàn)圖1中E和F).

3)紫花地丁的愈傷組織培養(yǎng)7 d后有懸浮單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)(見(jiàn)圖1中G，H和I)，且在顯微鏡下可觀察到變形的長(zhǎng)細(xì)胞.繼代培養(yǎng)時(shí)，加入等量的新鮮培養(yǎng)液，搖勻后稍靜置，待大細(xì)胞團(tuán)塊沉降后分瓶，不需要過(guò)濾即可得到不含大細(xì)胞團(tuán)塊的培養(yǎng)物［7］.此時(shí)細(xì)胞記數(shù)的結(jié)果為1.32×103個(gè)/mL.

3 植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的反思

3.1 植物材料選擇是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素

通過(guò)對(duì)幾種校園內(nèi)常見(jiàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)的初步研究，發(fā)現(xiàn)大葉黃楊的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)最為旺盛，質(zhì)地也最為疏松.紫花地丁的愈傷組織質(zhì)地較致密，且生長(zhǎng)狀況良好，培養(yǎng)過(guò)程中只出現(xiàn)少量褐變現(xiàn)象.因此，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)材料以大葉黃楊、紫花地丁最為理想.

圖1 大葉黃楊、七子花和紫花地丁的單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)

圖2 大葉黃楊、七子花和紫花地丁的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

大葉黃楊為黃楊科植物，在南北方栽培都極為廣泛［8］，易栽易活，冬夏常青，取材方便，實(shí)驗(yàn)不受季節(jié)限制，且組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的效果都較好，是不可多得的用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)材料.懸浮培養(yǎng)時(shí)的紫花地丁出現(xiàn)輕度褐變現(xiàn)象，估計(jì)是懸液中的激素濃度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度等因素對(duì)多酚氧化酶(PPO)的生成及活性有一定的影響［9］.另外，由于植物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感［10］，懸浮培養(yǎng)中搖床的旋轉(zhuǎn)形成的剪切力［11］易造成對(duì)細(xì)胞的傷害，主要是對(duì)植物細(xì)胞壁的破壞，從而使PPO含量升高，這也是懸液發(fā)生褐變的原因之一.懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，學(xué)生發(fā)現(xiàn)有3瓶紫花地丁懸液發(fā)生雜菌污染，但懸液中的細(xì)胞并沒(méi)有死亡，且細(xì)胞增殖依然快速進(jìn)行，因此初步判定此培養(yǎng)液中帶入的雜菌為共生菌，并不明顯影響紫花地丁懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng).七子花的細(xì)胞培養(yǎng)尚未有成熟的方案.作為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物，七子花細(xì)胞培養(yǎng)方法的探索對(duì)七子花種群的擴(kuò)大及恢復(fù)有著重要的意義［12］.由于在組織培養(yǎng)中七子花的褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，不適于本科教學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

3.2 通過(guò)綜合實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生應(yīng)用知識(shí)解決問(wèn)題的能力

通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)的綜合實(shí)驗(yàn)，可以提高學(xué)生的實(shí)際操作能力，例如熟練使用顯微鏡、解剖器等.同時(shí)，通過(guò)聆聽(tīng)、觀察、閱讀、質(zhì)疑、記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，逐步提高學(xué)生的觀察能力.在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，植物細(xì)胞代謝緩慢，因而生長(zhǎng)速率低，需要很長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程，而且長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌狀態(tài)給培養(yǎng)帶來(lái)難度，尤其在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中極易發(fā)生污染，因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中十分強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作，這就大大提高了學(xué)生實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的耐心與細(xì)心.另外，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整理過(guò)程，通過(guò)表解、圖釋記錄實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行分析整理，找出實(shí)驗(yàn)成敗的原因，并通過(guò)查閱文獻(xiàn)等解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，進(jìn)一步提高了學(xué)生分析和解決問(wèn)題的能力.

3.3 因地制宜，靈活安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)度

由于植物細(xì)胞培養(yǎng)中涉及的許多實(shí)驗(yàn)材料都易受區(qū)域性、季節(jié)性的影響，所以在制定學(xué)期或?qū)W年實(shí)驗(yàn)計(jì)劃時(shí)必須要對(duì)全程教學(xué)內(nèi)容中所需的實(shí)驗(yàn)材料、藥品等有一個(gè)全盤的計(jì)劃和安排［13］.實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師應(yīng)制定出實(shí)驗(yàn)的具體日程，及時(shí)采集、購(gòu)買或培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料.在指定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃時(shí)應(yīng)根據(jù)植物的不同生長(zhǎng)期，適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)次序，制定適宜的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃.準(zhǔn)備的實(shí)驗(yàn)材料盡可能與教材的要求相一致.實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)該盡量新鮮，實(shí)驗(yàn)前必須保證儀器完好，藥品、材料準(zhǔn)備充足，以保證實(shí)驗(yàn)課圓滿地完成.

4 結(jié)束語(yǔ)

植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，實(shí)驗(yàn)采取小組制，加強(qiáng)了學(xué)生間的團(tuán)結(jié)，也鍛煉了學(xué)生進(jìn)行分工合作、統(tǒng)籌安排的能力.在提供足夠的材料時(shí)，能讓每個(gè)人都有機(jī)會(huì)學(xué)習(xí)，克服了在以往的教學(xué)中因?yàn)椴扇⌒〗M制使某些人沒(méi)有動(dòng)手機(jī)會(huì)的現(xiàn)象.由于植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，可以在繼代培養(yǎng)時(shí)穿插其他實(shí)驗(yàn)，盡量把材料的繼代時(shí)間安排為每周一次，這樣就在正常的實(shí)驗(yàn)課時(shí)段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不用另外抽時(shí)間進(jìn)行，可以保證高質(zhì)量、高效率地完成各項(xiàng)實(shí)驗(yàn).總之，通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，可以使學(xué)生掌握較多的細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)方法，鍛煉他們應(yīng)用科學(xué)知識(shí)分析和解決問(wèn)題的能力，培養(yǎng)其團(tuán)隊(duì)協(xié)作和創(chuàng)新精神.

［1］彭菲，魯耀邦，雷思琦.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研的有機(jī)結(jié)合［J］.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2009，28(11):117-119.

［2］周杰，王海英.《細(xì)胞工程》實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的建議與構(gòu)想［J］.實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2012，10(2):131-134.

［3］梁亦龍，魏進(jìn)民，張繼承.細(xì)胞工程教學(xué)改革的探索［J］.實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2009(8):25-26.

［4］趙德修，李茂寅.培養(yǎng)基及其組成對(duì)水母雪蓮懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及黃酮形成的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(1):99-102.

［5］王亞琴，葉青華，朱媛.杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸的初步研究［J］.廣西植物，2008，28(5):671-674.

［6］王健，郭政宏，劉海軍，等.魔芋細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)葡甘露聚糖的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(27):14836-14838.

［7］王俊麗，陳丕玲，楊慶仙.杜仲細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)［J］.河北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1997，17(3):78-80.

［8］張照玉.新型綠化苗木——大葉黃楊［J］.中國(guó)林業(yè)，2001，16(8):25.

［9］李冬杰，張進(jìn)獻(xiàn)，魏景芳，等.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中褐化的關(guān)系［J］.植物生理學(xué)通訊，2005，41(1):95-98.

［10］劉春朝，王玉春，鄭重，等.剪切力對(duì)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響［J］.化工冶金，1998，19(4):379-384.

［11］葉國(guó)洪，穆虹，徐鳳彩.培養(yǎng)條件對(duì)煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和CoQ10含量的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(2):42-45.

［12］劉鵬，徐根娣.在生境片斷化中光對(duì)七子花生理特性的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2003，39(4):43-47.

［13］朱愛(ài)意.搞好師范類生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)的幾點(diǎn)探索［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，19(1):98-100.