銅污染對煙草生長及其生理特性的影響

葛淑芳，章 藝，吳玉環(huán)，徐根娣，劉 鵬

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.浙江旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州311231;3.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 330036)

銅是植物生長所必需的微量營養(yǎng)元素，廣泛參與植株的各種生命活動.但是當細胞中銅濃度超過一定范圍時，就會對植物產(chǎn)生毒害作用［1］.近年來在農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域均有含銅污染物的大量排放，如含銅殺蟲劑的過度使用、工廠生產(chǎn)中含銅污染物的大量排出及銅礦的超標開采等等，導(dǎo)致不少地區(qū)土壤中的銅含量已超出植物可正常利用的范圍［2-4］.銅含量過高會導(dǎo)致煙草的生長發(fā)育、抗氧化系統(tǒng)等受到抑制甚至毒害作用，進而會影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，而煙草品質(zhì)的好壞通過煙草產(chǎn)品直接影響著人類的健康［5］.煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物，除制作烤煙外，煙草在食品和藥物資源方面的潛力也越來越多地被開發(fā)和利用，如:煙葉富含蛋白質(zhì)，再生能力強，一年可多次收獲，因而從鮮煙葉中提取蛋白，其產(chǎn)量明顯超過從大豆中獲得的蛋白;從煙葉中提取的煙堿是醫(yī)藥中常用的一種藥劑;煙草是著名的模式作物，也是生物技術(shù)中常用的生物反應(yīng)器，是抗癌、抗艾滋病等關(guān)系到人類健康基因表達的理想場所［6］.由此可見，煙草具有很高的綜合開發(fā)價值和經(jīng)濟價值，但是目前有關(guān)煙草遭受銅污染的深入研究卻鮮見報道.本文通過水培法研究了銅污染對煙草生長及生理特性的影響，以期為進一步探討銅污染下煙草的耐性機制提供一定的理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試材料與實驗設(shè)計

以耐銅性較強的煙草W38(Nicotiana tabacum L.var.W38)和耐銅性較弱的本氏煙(Nicotiana tabacum L.var.Benthamiana)為對比實驗材料.

先將煙草種子經(jīng)10%的H2O2溶液表面消毒20 min，然后在25℃下黑暗浸種24 h，之后播種到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，等種子發(fā)芽后移植到沙子中，待幼苗的第4片真葉展開后，選取長勢較為一致的幼苗移入到Hoagland 1/2完全營養(yǎng)液中，預(yù)培養(yǎng)3 d后再轉(zhuǎn)入完全營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)6 d，然后按以下處理繼續(xù)培養(yǎng):T0(Cu2+0.0 mg/L，即對照組);T1(Cu2+0.5 mg/L);T2(Cu2+1.0 mg/L);T3(Cu2+2.0 mg/L);T4(Cu2+4.0 mg/L);T5(Cu2+8.0 mg/L).其中，Cu2+以 CuSO4·5H2O 的形式提供.每3 d更換1次營養(yǎng)液.處理15 d后取樣進行相應(yīng)的生理指標的測定，每個處理3個重復(fù).實驗材料和實驗所用濃度是前期大量預(yù)試驗所得.

1.2 測定指標和方法

株高、根系長度用直尺直接測量;植株鮮質(zhì)量用電子天平稱量.根系活力采用氯化三苯四氮唑(TTC)法測定［7］;相對質(zhì)膜透性用電導(dǎo)儀測定［8］.過氧化氫酶(CAT)活性參照Monnet等［9］的方法測定;超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性參照文獻［10］的方法測定;游離脯氨酸(Pro)含量測定參照張殿忠等［11］的茚三酮顯色法;丙二醛(MDA)含量采用巴比妥酸顯色法［12］.

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定均設(shè)3次重復(fù)，計算平均值和標準誤差.數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件中的Duncan法進行顯著性差異分析，用Excel 2007軟件和Origin 8.0軟件制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度銅處理對煙草生長特性的影響

從表1可以看出:在銅質(zhì)量濃度低于1.0 mg/L時，煙草W38和本氏煙的根長、株高和鮮質(zhì)量均隨著銅濃度的增加而增加，說明低濃度的銅處理對煙草生長有促進作用;當銅濃度高于1.0 mg/L時，這些參數(shù)值均隨著銅濃度的增加而顯著性降低(P＜0.05);當銅濃度為4.0 mg/L時，本氏煙開始出現(xiàn)輕度傷害癥狀，葉片輕微失綠，質(zhì)量下降，而煙草W38未表現(xiàn)出抑制癥狀;當銅濃度為8.0 mg/L時，本氏煙受到重度傷害，表現(xiàn)為煙株葉片發(fā)黃，嚴重者出現(xiàn)枯萎癥狀，且質(zhì)量降低為對照的54.49%，而煙草W38出現(xiàn)了中度傷害癥狀，植株矮小.由此說明了2個品種煙草的耐銅性差異.煙草W38生物量的增加值總體上高于本氏煙，但是株高相對低于本氏煙，這可能是植株形態(tài)差異性造成的.

表1 不同濃度銅處理對煙草幼苗生長特性的影響

2.2 不同濃度銅處理對煙草根系活力及質(zhì)膜透性的影響

根系活力大小反映了根系代謝能力的強弱，直接影響植株的生長和抗逆性.氯化三苯基四氮唑還原力反映了細胞內(nèi)總脫氫酶的活性，是反映植物體代謝活動的一個重要指標.由表2可知:當銅處理濃度為0.5 mg/L時，2個品種煙草的根系活力均達到最大峰值，煙草W38的根系活力大于本氏煙;當銅濃度大于1.0 mg/L時，2個品種煙草的根系活力隨著銅濃度的增加而顯著性降低;在銅濃度為2.0 mg/L時，煙草W38與本氏煙根系活力與對照相比分別下降了1.56%和13.41%，可見銅敏感型的本氏煙受到的抑制程度更大.

植物細胞外滲液的電導(dǎo)率可作為植物細胞膜透性變化和損傷的標志.由表2可知:當銅處理濃度小于0.5 mg/L時，2個品種煙草的根系細胞膜透性隨著銅處理濃度的升高而下降;當銅處理濃度大于1.0 mg/L時，細胞膜透性則隨著銅處理濃度的升高而上升.在銅處理下，本氏煙的根系細胞膜透性明顯高于煙草W38.當銅濃度為4.0 mg/L時，煙草W38的根系細胞膜透性與銅濃度為2.0 mg/L時無顯著性差異，但本氏煙卻有顯著性差異，這些進一步說明了本氏煙的抗逆性較弱.

表2 不同濃度銅處理對煙草根系活力及質(zhì)膜透性的影響

2.3 不同濃度銅處理對煙草抗氧化酶活性的影響

由圖1，圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著銅處理濃度的增高，2個品種煙草根系中的 CAT，SOD和POD的活性都隨著銅濃度的增高呈先增后降的變化趨勢.

CAT主要存在于植物過氧化物酶體和乙醛酸循環(huán)體中，是清除H2O2的主要酶類，其主要作用是清除光呼吸所產(chǎn)生的H2.圖 1 表明:在銅濃度小于0.5 mg/L時，2個品種煙草的CAT活性隨著銅濃度的增加而升高，但與對照相比，本氏煙差異不顯著;當銅濃度大于1.0 mg/L時，2個品種煙草的CAT活性隨著銅濃度的增加而降低，其中煙草W38的CAT活性與低濃度銅處理時的無顯著性差異，但本氏煙的CAT活性顯著性下降;當銅處理濃度增加到2.0 mg/L和4.0 mg/L時，煙草W38的CAT活性無顯著性變化，本氏煙的CAT活性顯著降低.這說明煙草W38本身具有較高的活性氧自由基清除能力，表現(xiàn)出耐銅性，而本氏煙清除活性氧的能力有限.

作為植物的第一道防線［14］，SOD能清除細胞內(nèi)多余的超氧自由基，防止膜脂過氧化作用.由圖2可知，SOD活性的變化趨勢與CAT活性一致，說明了2個品種煙草耐銅性的差異.

POD是植物體內(nèi)有毒物質(zhì)的清除劑，在重金屬脅迫下，POD在提高植物耐脅迫性方面有重要的作用.由圖3可知，煙草W38和本氏煙的POD活性變化趨勢一致.當銅濃度小于1.0 mg/L時，2個品種煙草的POD活性相對于對照組均有所增強，銅濃度為0.5 mg/L時POD活性最強;當銅的處理濃度大于1.0 mg/L時，POD活性均隨著銅濃度的升高而降低;當銅濃度為8.0 mg/L時，2個品種煙草的POD活性都受到強烈的抑制，甚至影響了植株的正常生長發(fā)育.

圖1 不同濃度銅處理對煙草CAT活性的影響

圖2 不同濃度銅處理對煙草SOD活性的影響

圖4 不同濃度銅處理對煙草Pro含量的影響

2.4 不同濃度銅處理對煙草Pro含量的影響

由圖4可知，2個品種煙草的Pro含量隨著銅濃度的增加而增加.其中，煙草W38的Pro含量在銅脅迫下差異不顯著，而本氏煙在銅濃度為8.0 mg/L時Pro含量與低濃度銅處理時相比有顯著性變化.這可能是由于高強度的銅脅迫對銅敏感型的本氏煙產(chǎn)生了毒害作用.

圖3 不同濃度銅處理對煙草POD活性的影響

圖5 不同濃度銅處理對煙草MDA含量的影響

2.5 不同濃度銅處理對煙草MDA含量的影響

MDA是植物體內(nèi)膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量變化可以反映出植物細胞受損傷的程度.從圖5可知，隨著銅濃度的增加，煙草W38和本氏煙體內(nèi)的MDA含量均呈現(xiàn)先增加、后降低的趨勢.過高的MDA含量是植物受到氧化損傷的一個信號.在銅濃度為4.0 mg/L時，2個品種煙草的MDA含量均達到最大值，是對照的3倍多，且與對照組相比達到顯著性差異，說明該濃度的銅處理對煙草脅迫程度較大.但是，在濃度為8.0 mg/L銅處理下，2個品種煙草的MDA含量相對于4.0 mg/L銅脅迫下卻有所降低，且差異顯著，這可能是因為高濃度銅處理導(dǎo)致煙株的細胞內(nèi)積累了大量的活性氧，最終使其失去了正常的生理代謝功能.

3 討論與結(jié)論

銅可以影響細胞質(zhì)的生理代謝，干擾細胞有絲分裂的能量供給，故有絲分裂中會出現(xiàn)分裂數(shù)目變少、分裂速度變慢的現(xiàn)象，進而導(dǎo)致植株的代謝紊亂、發(fā)育受阻，嚴重時則會發(fā)生植株死亡［15］.本研究發(fā)現(xiàn)，煙草植株生長在低濃度(0.5 mg/L，1.0 mg/L)銅處理時與對照相比生長發(fā)育狀況良好，其根長、株高及單株鮮質(zhì)量均與對照相比呈現(xiàn)升高趨勢，且差異顯著.但是，當銅濃度進一步增加后，上述指標則呈現(xiàn)不斷下降的趨勢.當銅濃度為2.0，4.0 mg/L 時，植株外傷癥狀不明顯，但其生長受到抑制;當銅濃度加大為8.0 mg/L時，2個品種的煙草均出現(xiàn)嚴重的外傷癥狀，葉片發(fā)黃，須根呈深褐色.這與韋美玉等［16］發(fā)現(xiàn)低濃度CuSO4處理對芹菜生長有促進作用，隨銅濃度遞增則對芹菜生長有抑制作用的研究結(jié)果是一致的.

根系是植物最早感受到土壤逆境脅迫信號的器官，植物接收到逆境信號后會作出相應(yīng)的調(diào)整以適應(yīng)逆境.研究發(fā)現(xiàn)，植物根系活力大小與其抗逆境能力呈正相關(guān)關(guān)系，根系活力大則植物的抗逆境能力強，反之則弱［17］.本研究中，在既定處理時間內(nèi)，煙草的根系活力隨著銅處理濃度的升高而呈現(xiàn)先顯著增大、再降低的趨勢，這與劉鵬等［18］對煙草的研究結(jié)果一致.細胞質(zhì)膜是細胞與環(huán)境之間的界面與屏障，逆境脅迫下活性氧自由基會在植物體內(nèi)大量產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致膜脂中的不飽和脂肪酸出現(xiàn)過氧化，進而破壞生物膜的正常生理功能并致使質(zhì)膜損傷與電解質(zhì)異常流出［19］.植物細胞原生質(zhì)膜的完整性和穩(wěn)定性在營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、運輸和維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中扮演著非常重要的角色.植物細胞外滲液的電導(dǎo)率與所受污染物的濃度成正相關(guān)關(guān)系，由此可將細胞膜透性大小作為植物抵抗逆境的評價指標之一［20］.本實驗中，隨著銅處理濃度的不斷升高，煙草根系細胞膜透性呈現(xiàn)出先降低、后升高的趨勢，說明低濃度銅處理增強了煙草生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而高濃度銅處理嚴重破壞了細胞膜的完整性.這可能是因為過量的銅致使細胞膜系統(tǒng)遭到破壞，大量銅滲入到細胞內(nèi)并與細胞膜蛋白的—SH或磷脂分子層的磷脂類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而改變了膜蛋白的磷脂結(jié)構(gòu)和細胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細胞膜的透性增大.

植物受到逆境脅迫時會造成體內(nèi)自由基的過量積累，從而損傷細胞膜結(jié)構(gòu)，進而致使細胞生理生化代謝的紊亂.然而，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的一系列抗氧化酶可以應(yīng)對活性氧的大量積累，其中不同的酶在植物抵抗逆境脅迫中有著各自不同的功能［21］.本實驗中，2個品種煙草的 POD，SOD和CAT的活性隨著銅濃度的增加呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，表明高濃度的銅會抑制煙草的POD，SOD和CAT的活性，從而造成3種保護酶的活性比例失調(diào)，故植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致煙草的生理代謝紊亂，加速了煙株各組織、器官的衰老.這與涂俊芳等［22］關(guān)于銅對紫背萍和青萍色素含量及抗氧化酶系統(tǒng)影響的報道結(jié)果一致，也和袁霞等［23］研究銅對小青菜葉片保護酶活性影響的結(jié)果相一致.

游離脯氨酸(Pro)作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物遭受脅迫誘導(dǎo)時會改變自身正常的代謝路徑，導(dǎo)致體內(nèi)Pro的氧化受阻，進而使其含量升高，而Pro含量的升高可以降低水勢以維持植物體內(nèi)環(huán)境中的水分平衡，從而保證了植物的正常生長發(fā)育.本研究中，煙草根系Pro的含量隨著銅處理濃度的增大而增加，可能是由于當煙草受到銅脅迫時，外界的脅迫越大，植株自身則需要更多的Pro來應(yīng)對以維持其生長.這與俞慧娜等［24］的研究結(jié)果是一致的.有研究指出，抗逆性越強的植物品種中游離Pro的含量也越高［25］.本實驗中也發(fā)現(xiàn)，抗銅性大的煙草品種W38的游離脯氨酸含量相對高于銅敏感型的本氏煙.

植物體內(nèi)MDA含量的多少可以較客觀地反映出植物細胞膜過氧化的程度和抵抗逆境能力的強弱［26］.本研究中，盡管銅污染處理時保護性酶的活性增強，但是這并不能完全清除銅脅迫產(chǎn)生的氧自由基，這從脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量隨著銅處理濃度的提高而上升的趨勢就可以得知，說明銅處理增加了植物體內(nèi)的膜質(zhì)過氧化水平.

本研究結(jié)果顯示，銅對煙草的生長存在著劑量效應(yīng).當銅處理濃度低于1.0 mg/L時，能在一定程度上促進煙草的生長發(fā)育，從而可用于改善煙草的品質(zhì).但是，較高濃度的銅處理(大于1.0 mg/L)對煙草表現(xiàn)出抑制作用.

［1］Polle A，Schützendübel A.Heavy metal signalling in plants:linking cellular and organismic responses［J］.Plant Responses to Abiotic Stress:Topics in Current Genetics，2004，4:187-215.

［2］王友保，劉登義.Cu、As及其復(fù)合污染對小麥生理生態(tài)指標的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2001，12(5):773-776.

［3］茍本富.銅脅迫對蠶豆幼苗基因組DNA損傷效應(yīng)的研究［J］.北方園藝，2011(4):158-160.

［4］Xiong Zhiting，Liu Chao，Geng Bing.Phytotoxic effects of copper on nitrogen metabolism and plant growth in Brassica pekinensis Rupr［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2006，64(3):273-280.

［5］張艷英，周楠，劉鵬，等.銅脅迫對煙草幼苗氮代謝的影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2009，29(12):6779-6784.

［6］P?tsikk? E，Aro E M，Tyystj?rvi E.Increase in the quantum yield of photoinhibition contributes to copper toxicity in vivo［J］.Plant Physiol，1998，117(2):619-627.

［7］張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，2003:39-40.

［8］劉鐵錚，趙習平.電導(dǎo)法測定杏葉片細胞質(zhì)膜相對透性的研究［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12(1):33-34.

［9］Monnet F，Bordas F，Deluchat V，et al.Toxicity of copper excess on the lichen Dermatocarpon luridum:antioxidant enzyme activities［J］.Chemosphere，2006，65(10):1806-1813.

［10］De Azevedo Neto A D，Prisco J T，Enéas-Filho J，et al.Effect of salt stress on antioxidative enzymes and lipid peroxidation in leaves and roots of salt-tolerant and salt-sensitive maize genotypes［J］.Environmental and Experimental Botany，2006，56(1):87-94.

［11］張殿忠，汪沛洪，趙會賢.小麥葉片游離脯氨酸含量的測定［J］.植物生理學(xué)通訊，1990，26(4):62-65.

［12］張憲政.作物生理研究法［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1983.

［13］陳林林，吳玉環(huán)，王月平，等.Ni、Pb、Cd 復(fù)合脅迫對葡燈蘚生理特性的影響［J］.水土保持學(xué)報，2013，27(4):228-233.

［14］Bowler C，Montagu M V，Inze D.Superoxide dismutase and stress tolerance［J］.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1992，43:83-116.

［15］甄泉，嚴密，楊紅飛，等.銅污染對野艾蒿生長發(fā)育的脅迫及傷害［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17(8):1505-1510.

［16］韋美玉，劉麗萍.銅污染對芹菜生長及生理特性的影響［J］.北方園藝，2011(9):33-36.

［17］Peter M A，Karl L，Ruth P.Modification of the lipid-protein interaction in human low-density lipoprotein destabilizes and decreases oxidizability［J］.Biochemistry，1999，38(2):3401-3408.

［18］劉鵬，張艷英，吳玉環(huán)，等.銅脅迫對煙草養(yǎng)分吸收和根系生理的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，32(4):442-447.

［19］余叔文，湯章城.植物生理與分子生物［M］.2版.北京:科學(xué)出版社，1998.

［20］王芳，黃朝表，劉鵬，等.鋁對蕎麥和金蕎麥根系分泌物的影響［J］.水土保持學(xué)報，2005，19(2):106-109.

［21］杜世章，劉婷婷，代其林，等.輻照對煙草抗氧化酶活性的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2012，14(1):72-75.

［22］涂俊芳，王興明，劉登義，等.不同濃度銅對紫背萍和青萍色素含量及抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17(3):502-506.

［23］袁霞，李艷梅，張興昌.銅對小青菜生長和葉片保護酶活性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，27(2):467-471.

［24］俞慧娜，徐根娣，楊衛(wèi)韻，等.錳處理對大豆生理特性的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(7):35-38.

［25］林曉民.辣椒花藥中游離脯氨酸含量與植物抗病毒性的關(guān)系［J］.植物生理學(xué)通訊，1996(5):354-358.

［26］馮世座，劉合芹.極端溫度對秈粳稻苗期光合特性及生理生化特性的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，35(3):330-337.