慢病毒載體及其介導(dǎo)的RNA干擾在基因治療中的應(yīng)用研究*

趙鐵軍， 倪偉海， 鄭有芳， 郭一孚， 蔣歡樂， 徐 怡

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

慢病毒(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，它主要包括8種能夠感染人和脊椎動(dòng)物的RNA病毒.此類病毒的共同之處在于它們都具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)和特性[1].慢病毒載體(lentiviral vector，LV)系統(tǒng)是以慢病毒基因組為基礎(chǔ)、人工改造構(gòu)建而成的一種病毒載體.它利用慢病毒的高感染性、高表達(dá)性、可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞等諸多特性，通過感染細(xì)胞或組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或組織中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)[2].由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，慢病毒載體作為一種新型的生物資源已成為當(dāng)前生物及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3].

1 慢病毒載體

1.1 慢病毒載體的構(gòu)建

應(yīng)用最為廣泛的慢病毒載體系統(tǒng)包含整合質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒.整合質(zhì)粒主要含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所必須的作用原件，而且具有多克隆位點(diǎn)，及插入到該位點(diǎn)的目的基因.包膜質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒構(gòu)成了慢病毒載體的包裝系統(tǒng)，它提供慢病毒包裝所需的蛋白質(zhì)外殼部分.病毒外殼主要由gag，pol，env和rev蛋白所組成，它們大多來自水泡性口炎病毒包膜蛋白(vesicular stomatitis virus G-protein，VSV-G).在慢病毒載體構(gòu)建過程中，首先使整合質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)?；旌铣扇|(zhì)粒混合體系，然后用該混合體系轉(zhuǎn)染用于包裝的細(xì)胞株，最后培養(yǎng)得到所需的慢病毒載體(見圖1).

圖1 慢病毒載體的形成過程

1.2 慢病毒載體的優(yōu)勢

利用慢病毒載體導(dǎo)入外源基因主要有以下優(yōu)勢[4-5]：第一，慢病毒載體感染對象廣，可轉(zhuǎn)染處于有絲分裂期和非有絲分裂期的細(xì)胞；第二，由慢病毒載體攜帶整合到宿主基因組的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄后水平的基因沉默有一定的抵抗能力；第三，目的基因在慢病毒載體介導(dǎo)下均可在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)持久穩(wěn)定的表達(dá)；第四，第3代慢病毒載體中只保留了gag，pol和rev3個(gè)病毒基因[5]，且慢病毒載體具備自我失活的能力，作用過程中癌基因不會(huì)被激活，這保證了慢病毒載體的安全性[6].由于慢病毒載體具有如上眾多的優(yōu)勢，使得慢病毒載體成為一種能實(shí)現(xiàn)外源基因的高效導(dǎo)入及應(yīng)用于疾病的基因治療等方面的具有良好應(yīng)用前景的生物資源而得到廣泛應(yīng)用.

1.3 慢病毒載體的應(yīng)用

1.3.1 基因治療

1)HIV感染疾病治療

目前使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物可較為有效地延長從感染病毒到出現(xiàn)艾滋病病癥之間的間隔時(shí)間[7].雖然這種治療方法在治療前期可以取得良好的效果，但因其在治療過程中不可避免地使艾滋病患者產(chǎn)生抗藥性，使其在后期的治療過程中難以取得理想的治療效果[8].相比之下，采用慢病毒載體治療HIV-1感染具有許多優(yōu)勢[9]：第一，慢病毒載體主要改造自HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)，可以與病毒RNA競爭包裝蛋白和用于病毒復(fù)制的病毒蛋白，從而抑制病毒復(fù)制，控制HIV的感染；第二，慢病毒載體可以攜帶有抗HIV病毒的基因，特異地對病毒復(fù)制進(jìn)行控制.

2)腫瘤疾病治療

傳統(tǒng)治療腫瘤的方法多以手術(shù)切除、放療、藥物控制等為主，基因治療的出現(xiàn)為腫瘤治療提供了一種全新的思路.慢病毒載體可以安全有效地將治療腫瘤基因植入人體內(nèi)，并使其得以長期有效地表達(dá).例如，在對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中，利用慢病毒載體向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中導(dǎo)入下調(diào)BCL2和TRAIL基因表達(dá)的shRNA，可激活細(xì)胞半胱氨酸3和半胱氨酸7的表達(dá)，從而加速神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[10].因此，可以利用慢病毒載體為腫瘤的治療提供一種有效導(dǎo)入藥物的手段.

1.3.2 研發(fā)新疫苗及新藥物

流感病毒疫苗主要以流感病毒表面血凝素和神經(jīng)氨酸酶為抗原制備.但由于流感病毒的高度變異性，因此給疫苗的制備帶來了極大的困難.實(shí)驗(yàn)中，利用攜帶有流感病毒種屬特異性基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染特定的細(xì)胞株，從而獲得大量病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)[11-13]，這為制備流感病毒疫苗提供了保證.此外，利用上述方法制備疫苗具有如下優(yōu)點(diǎn)：第一，具有確切的種屬特異性；第二，VLP為顆粒狀，可以保證流感病毒蛋白具有最佳免疫原性；第三，可正確糖基化；第四，不含病毒蛋白；第五，可長時(shí)間收獲；第六，生產(chǎn)周期短，通常只需幾周的時(shí)間.

2 慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾

2.1 RNA干擾

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA特異性降解現(xiàn)象，是生物進(jìn)化中一項(xiàng)保守的防御機(jī)制.在細(xì)胞中，雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)被Dicer酶剪切成大小為21～26 bp的siRNA.之后，siRNA經(jīng)解旋酶作用形成正義鏈和反義鏈，siRNA反義鏈再與細(xì)胞內(nèi)的一些酶(解旋酶、內(nèi)切酶、外切酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex,RISC)；接著，在siRNA反義鏈指導(dǎo)下，RISC與其互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致RNA發(fā)生特異性降解[14-17].

RNAi可導(dǎo)致目的基因的特異性沉默，從而可將其應(yīng)用到基因敲除的實(shí)驗(yàn)中.因RNAi具有高穩(wěn)定性、高特異性、高效性和可傳播性等諸多優(yōu)點(diǎn)，使得該技術(shù)在探索基因功能、抗病毒感染、基因治療和抗腫瘤方面得到了廣泛應(yīng)用.

2.2 慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi

慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi是運(yùn)用慢病毒載體將RNAi片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而抑制同源mRNA的表達(dá).該方法將慢病毒載體的高感染性、高表達(dá)性與RNAi的特異性相結(jié)合.慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi與其他方式介導(dǎo)的RNAi相比，具有可使目的基因產(chǎn)生持續(xù)而穩(wěn)定沉默的顯著優(yōu)點(diǎn).

慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi主要有2種類型：一類分別轉(zhuǎn)錄生成正義鏈和反義鏈RNA，之后2條鏈互補(bǔ)生成siRNA；另一類則生成包含啟動(dòng)子、終止子和shRNA結(jié)構(gòu)序列的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA).基于shRNA的慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾在實(shí)際操作過程中更為常見，其主要由shRNA表達(dá)框和慢病毒載體組成.攜帶外源基因的慢病毒載體將shRNA表達(dá)框整合進(jìn)宿主基因組，進(jìn)而被轉(zhuǎn)錄，形成2段堿基序列互補(bǔ)的核苷酸鏈配對結(jié)合，中間呈現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu).之后，Dicer酶識別并切除莖環(huán)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生能執(zhí)行RNAi的siRNA(見圖2).

圖2 慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾

2.3 慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾在基因治療中的應(yīng)用

2.3.1 抗病毒感染

病毒具有自我復(fù)制能力強(qiáng)、感染擴(kuò)散速度快等特性，因此抗病毒治療過程中應(yīng)該采用穩(wěn)定、高效、迅速的辦法才能取得較好的治療效果.在相關(guān)的研究中，對抗病毒感染主要從病毒的感染途徑和作用機(jī)制兩方面入手.在這些研究中，發(fā)現(xiàn)阻斷病毒感染途徑或抑制其疾病發(fā)生過程中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)?？扇〉幂^為良好的效果.而正因?yàn)槁《据d體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)滿足穩(wěn)定、高效和迅速的要求，因此目前常被用來實(shí)現(xiàn)抗病毒感染的基因治療.

HIV-1病毒在感染初期時(shí)，通過與DC特異性IGN受體(DC-SIGN)結(jié)合，然后侵入到CD4+ T淋巴細(xì)胞.之后，利用宿主細(xì)胞內(nèi)的核苷酸、氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行迅速復(fù)制，組裝成大量新的病毒粒，然后釋放到細(xì)胞間隙中，繼續(xù)攻擊宿主細(xì)胞周圍的其他CD4+ T淋巴細(xì)胞，最終造成大量CD4+ T淋巴細(xì)胞死亡，機(jī)體免疫機(jī)能崩潰.在治療HIV-1病毒感染過程中，HIV-1病毒與DC-SIGN受體的結(jié)合是病毒感染初期的關(guān)鍵步驟，若能抑制DC-SIGN受體的表達(dá)，就可以減弱病毒顆粒與它的結(jié)合，進(jìn)而有效地抑制HIV-1的感染能力.慢病毒載體介導(dǎo)的針對DC-SIGN的RNAi，可顯著抑制原代培養(yǎng)DC(dendritic cell)中DC-SIGN的表達(dá).用HIV-1病毒感染該DC-SIGN表達(dá)被抑制的DC，發(fā)現(xiàn)HIV-1病毒與DC-SIGN的結(jié)合能力大大下降；再將上述HIV-1病毒顆粒感染后的DC與CD4+ T淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)HIV-1感染CD4+ T淋巴細(xì)胞的效率明顯降低[18].

2.3.2 癌癥治療

原癌基因的異?；顒?dòng)常會(huì)誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生.慢病毒載體能實(shí)現(xiàn)各類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中原癌基因的RNAi，抑制原癌基因的表達(dá)，從而降低癌變細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散能力，有效地延緩癌癥的發(fā)生和治療癌癥.原癌基因BRAF的突變會(huì)引起黑色素瘤(malignant melanoma,MM)的發(fā)生.而MM細(xì)胞系的BRAF基因一般有2種表達(dá)方式：一種是野生型；另一種是突變型.后者的BRAF基因可以大量表達(dá).利用慢病毒載體在MM細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)針對BRAF基因的RNAi，可以有效地抑制BRAF基因的表達(dá)，且降低MM BRAF突變型細(xì)胞系的增殖能力；相同處理過的野生型MM細(xì)胞系未表現(xiàn)出上述現(xiàn)象[19].運(yùn)用慢病毒載體在肝臟腫瘤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)針對EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)的RNAi，可以使腫瘤細(xì)胞衰老和死亡.在小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1中，轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(Signal transducer and activator of transcription,STAT3)常因原癌基因的激活而大量表達(dá)，并且磷酸化.如果將小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1注射到野生型小鼠乳腺中，小鼠將會(huì)發(fā)生乳腺癌.而用慢病毒載體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)針對4T1細(xì)胞系STAT3的RNAi，96 h后STAT3的表達(dá)和磷酸化幾乎被完全抑制；之后,將該處理過的細(xì)胞系注射到野生型小鼠乳腺中，發(fā)現(xiàn)其幾乎喪失了誘導(dǎo)小鼠乳腺癌的能力[20].人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)蛋白E6/E7在人類宮頸癌發(fā)生過程中起著極其關(guān)鍵的作用.研究者使用慢病毒載體介導(dǎo)，將針對E6/E7基因啟動(dòng)子和E6 mRNA的shRNA導(dǎo)入到2種宮頸癌細(xì)胞株Siha和Caski，結(jié)果發(fā)現(xiàn),在2個(gè)細(xì)胞株內(nèi)E6/E7蛋白的表達(dá)均受到了明顯抑制，2個(gè)細(xì)胞株的增殖和入侵能力也大幅度下調(diào)[21-22].綜上可以看出，使用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以特異性地沉默目的基因，并且有效地抑制了相關(guān)癌細(xì)胞的增殖和遷移，這提示我們將慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床治療癌癥具有很大的潛能[23-24].

2.3.3 遺傳疾病治療

慢病毒載體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)為遺傳疾病的基因治療開辟了一條新思路，目前的許多研究試圖從各類疾病的人源細(xì)胞模型和動(dòng)物體細(xì)胞模型2個(gè)方面找到相應(yīng)的應(yīng)用點(diǎn).超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)基因的突變常會(huì)導(dǎo)致遺傳性肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS).利用發(fā)生SOD1基因點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)基因鼠作為遺傳性ALS的一種動(dòng)物模型.在該模型動(dòng)物的椎管內(nèi)注射介導(dǎo)針對突變型SOD1 RNAi的慢病毒載體，從而實(shí)現(xiàn)針對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞SOD1的RNAi.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變型轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)的SOD1表達(dá)量顯著降低，ALS病癥出現(xiàn)的時(shí)間延后，且發(fā)病速度也得到減緩[25].在人源細(xì)胞模型方面，常以鐮刀型細(xì)胞貧血癥(sickle cell anemia,SCA)患者的離體細(xì)胞作為模型.鐮刀型細(xì)胞貧血癥常由β珠蛋白基因突變引起.利用慢病毒載體實(shí)現(xiàn)針對β珠蛋白基因的RNAi，結(jié)果顯示β珠蛋白的表達(dá)量明顯降低[26-27].綜合這兩個(gè)方向的研究，可以推測，慢病毒載體為在患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)針對致病基因的RNAi提供了可能，進(jìn)而為疾病的治療提供了一個(gè)新方向.

3 展 望

慢病毒具有感染能力強(qiáng)、導(dǎo)入基因持久穩(wěn)定、外源基因表達(dá)量高等諸多優(yōu)點(diǎn)，而且它既能感染體細(xì)胞，也能抑制各類疾病人源細(xì)胞中致病基因的表達(dá)，為高效穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)病人體內(nèi)特定基因的RNA干擾提供了可能性.利用慢病毒的特性，把它作為一種載體工具用于研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制及基因治療方法的開發(fā)，一方面提高了實(shí)驗(yàn)效率，另一方面也極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本.利用慢病毒的特性實(shí)現(xiàn)對特定基因的沉默，為腫瘤相關(guān)疾病的基因治療和新型基因藥物的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)手段.

綜上所述，慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)具有高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)最佳的RNAi.因此，慢病毒載體在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，能為基因治療提供有效的手段和有力的工具.

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