光譜法研究EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白的相互作用*

趙麗麗， 田 淼， 馮 潔， 趙玉玲

(1.浙江中鼎檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 義烏 322000；2.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

血清白蛋白是一種球蛋白，可以與無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物及小分子藥物等結(jié)合，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的作用[1-3].鐵作為人體內(nèi)最豐富的過(guò)渡金屬和微量元素之一，主要通過(guò)與血清白蛋白的相互作用發(fā)揮其生物效應(yīng)[4-5].EDTA-Fe(Ⅲ)是乙二胺四乙酸鐵鈉(sodium iron EDTA)的重要成分，其中的鐵元素能夠被血液很好地吸收，在補(bǔ)鐵方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6].我國(guó)已于2002年批準(zhǔn)將EDTA鐵鈉用于強(qiáng)化醬油，以此改善人們的生活質(zhì)量.

紫外光譜和熒光光譜是研究生物大分子與小分子相互作用的重要手段[7-9].通過(guò)研究小分子微擾的蛋白質(zhì)光譜變化，可以推斷生色基微環(huán)境及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并且可以推斷小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.但是，紫外光譜由電子躍遷產(chǎn)生，得到的是寬闊的譜帶，難以分辨蛋白質(zhì)中氨基酸殘基吸收譜帶的振動(dòng)結(jié)構(gòu).而熒光光譜則是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效方法，通過(guò)結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、能量轉(zhuǎn)移效率及蛋白質(zhì)構(gòu)象等的測(cè)定，可以進(jìn)行定性、定量研究.本文應(yīng)用紫外光譜和熒光光譜技術(shù)對(duì)EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白之間的相互作用進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

Shimadzu UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；PE LS-55熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司)；賽多利斯電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；微量注射器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司).

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)購(gòu)自華美生物工程公司；檸檬酸鐵(ferric citrate)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；鹽酸(HCl)、氯化鈉(NaCl)和氫氧化鈉(NaOH)均為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水為亞沸蒸餾去離子水.

1.2 溶液配制

配制50 mmol/L Tris-HCl并含100 mmol/L NaCl的緩沖溶液，維持體系的pH=7.0和離子強(qiáng)度，并以此緩沖溶液配制牛血清白蛋白(BSA)儲(chǔ)備液.

加熱檸檬酸鐵溶液至沸騰，慢慢加入Na2EDTA溶液，且不停地?cái)嚢?，得到黃色的EDTA-Fe(Ⅲ)溶液.制備過(guò)程中的副產(chǎn)物檸檬酸鈉鹽在測(cè)定波長(zhǎng)下對(duì)EDTA-Fe(Ⅲ)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜(數(shù)據(jù)未列出)沒有影響.

1.3 測(cè)定方法

在一系列5 mL比色管中，依次加入牛血清白蛋白溶液和EDTA-Fe(Ⅲ)溶液，以緩沖溶液稀釋至刻度，分別測(cè)定：1)310 K溫度下的紫外光譜；2)293 K和313 K溫度下的熒光光譜、同步熒光光譜及與蛋白質(zhì)物質(zhì)的量比為1∶1的EDTA-Fe(Ⅲ)的吸收光譜.測(cè)定中固定牛血清白蛋白的濃度為1.87×10-7mol5L-1,僅改變EDTA-Fe(Ⅲ)的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的紫外光譜

牛血清白蛋白在紫外區(qū)的特征吸收峰位置為280 nm波長(zhǎng)附近，主要是色氨酸殘基、酪氨酸殘基和苯丙氨酸殘基的吸收引起的.當(dāng)小分子物質(zhì)與牛血清白蛋白結(jié)合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致牛血清白蛋白吸收光譜的強(qiáng)度和譜帶位置發(fā)生變化.若蛋白質(zhì)的吸收峰增強(qiáng)，則可認(rèn)為小分子物質(zhì)進(jìn)入了蛋白質(zhì)的疏水腔，導(dǎo)致肽鏈伸展，疏水環(huán)境下降[10].隨著EDTA-Fe(Ⅲ)濃度的增加，牛血清白蛋白在278 nm波長(zhǎng)的最大吸收峰逐漸增強(qiáng)，且峰位輕微藍(lán)移(見圖1).而EDTA-Fe(Ⅲ)在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有吸收(數(shù)據(jù)未列出).由此推

a→f分別為c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0

測(cè)EDTA-Fe(Ⅲ)進(jìn)入了蛋白質(zhì)的疏水腔，導(dǎo)致肽鏈伸展，疏水環(huán)境下降，深埋于蛋白質(zhì)非極性區(qū)的生色基被暴露于極性溶劑.紫外光譜分析結(jié)果表明，EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白發(fā)生了相互作用，但具體的作用力類型及對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響需要通過(guò)熒光光譜分析來(lái)確認(rèn).

2.2 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的熒光猝滅

a→h分別為c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0

固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描波長(zhǎng)300～500 nm的熒光光譜.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EDTA-Fe(Ⅲ)在300～500 nm不發(fā)射熒光(數(shù)據(jù)未列出)；牛血清白蛋白在波長(zhǎng)344.5 nm處有最大熒光發(fā)射峰，主要來(lái)自色氨酸殘基和酪氨酸殘基；EDTA-Fe(Ⅲ)的加入使牛血清白蛋白的最大熒光發(fā)射峰產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，發(fā)射波長(zhǎng)輕微藍(lán)移，峰形保持不變(見圖2).說(shuō)明EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白發(fā)生了作用，出現(xiàn)了典型的熒光猝滅現(xiàn)象.

熒光體與猝滅體相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅，并有動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅之分：動(dòng)態(tài)猝滅是由熒光體與猝滅體之間的碰撞作用導(dǎo)致的；靜態(tài)猝滅則是由猝滅體與熒光體之間形成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物所導(dǎo)致的.通常先假設(shè)為動(dòng)態(tài)猝滅，服從斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程[11]

(1)

式(1)中:F0為猝滅體不存在時(shí)熒光體的熒光強(qiáng)度;F為猝滅體加入后的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅常數(shù);[Q]為猝滅體的濃度;τ0為猝滅體不存在時(shí)熒光體的熒光壽命；KD為Stern-Volmer常數(shù).對(duì)F0/F與[Q]進(jìn)行線性擬合，得到一條直線，由直線斜率求出KD/(L5mol-1)=9.05×103(見圖2(a))，1.02×104(見圖2(b)).由于熒光平均壽命大約為10-8s[12]，因此可求得猝滅常數(shù)Kq/(L5mol-15s-1)=9.05×1011(見圖2(a))，1.02×1012(見圖2(b)).當(dāng)猝滅劑對(duì)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)超過(guò)2.0×1010(L·mol-1·s-1)時(shí)為靜態(tài)猝滅[12].顯然,由圖2知EDTA-Fe(Ⅲ)對(duì)牛血清白蛋白熒光的猝滅常數(shù)大于擴(kuò)散控制猝滅常數(shù)，說(shuō)明2個(gè)溫度下EDTA-Fe(Ⅲ)對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅是形成基態(tài)復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅.

圖3 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的熒光猝滅對(duì)數(shù)曲線

2.3 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

如果小分子在蛋白質(zhì)上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，有公式[13]

(2)

表1 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.4 牛血清白蛋白與EDTA-Fe(Ⅲ)之間的能量轉(zhuǎn)移及結(jié)合距離

當(dāng)?shù)鞍追肿拥陌l(fā)射光譜與小分子物質(zhì)的吸收光譜相互重疊時(shí)，通過(guò)共振偶合可使能量從給體轉(zhuǎn)移到受體.依據(jù)福斯特(Forster)共振能量轉(zhuǎn)移理論[11]，可以求出小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的結(jié)合距離，由結(jié)合距離的變化分析小分子物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響.Forster共振能量轉(zhuǎn)移理論可表示為[11]：

ФJ;

(4)

(5)

式(3)中:E為能量轉(zhuǎn)移效率;r為小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合距離;R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離[11].式(4)中:K2=2/3,為偶極空間取向因子;N=1.36,為介質(zhì)的折射指數(shù);Φ=0.118,為授體的熒光量子產(chǎn)率;J為授體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜間的光譜重疊積分[14].式(5)中:F(λ)為熒光授體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；Δλ為熒光光譜和紫外吸收光譜中的波長(zhǎng)間隔;ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù)[14].由于在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下牛血清白蛋白的最大發(fā)射峰出現(xiàn)在344.5 nm處，且在其他區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)熒光發(fā)射峰的出現(xiàn)，因此，測(cè)定了在波長(zhǎng)300～370 nm EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白以1∶1的分子比結(jié)合時(shí)的紫外吸收光譜及牛血清白蛋白熒光發(fā)射光譜的重疊光譜(見圖4).參照文獻(xiàn)[15]，分別求得R0,E和r，數(shù)值列于表2.

牛血清白蛋白有2個(gè)色氨酸殘基，分別位于第134位和212位，而在實(shí)驗(yàn)條件(λex=280 nm，λem=335 nm)下，位于牛血清白蛋白疏水腔內(nèi)第212位的色氨酸殘基對(duì)牛血清白蛋白的熒光貢獻(xiàn)最大.通常，當(dāng)結(jié)合部位與氨基酸殘基之間的距離小于7 nm時(shí)有能量轉(zhuǎn)移發(fā)生.如果結(jié)合距離大于臨界距離，可推測(cè)能量轉(zhuǎn)移不是引起蛋白質(zhì)熒光猝滅的主要原因，其主要原因是靜態(tài)猝滅[14].因此，從r(4.80 nm和5.06 nm)均小于7 nm但大于R0(2.85 nm)推測(cè)，EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用過(guò)程中發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，但是能量轉(zhuǎn)移并不是引起牛血清白蛋白熒光猝滅的主要原因，其主要原因是靜態(tài)猝滅[15].

a:牛血清白蛋白的熒光發(fā)射光譜;b:EDTA-Fe(Ⅲ)的紫外吸收光譜

表2 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白相互作用的相關(guān)數(shù)據(jù)

2.5 EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白之間的相互作用力

小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的作用力主要有氫鍵和范德華力、靜電作用力、疏水作用力.通過(guò)比較反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的相對(duì)大小，能夠判斷小分子和蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型.若ΔH>0，ΔS>0，則為疏水作用力；若ΔH<0，ΔS>0，則為靜電作用力；若ΔH<0，ΔS<0，則為氫鍵和范德華力[16].根據(jù)熱力學(xué)知識(shí)，ΔH基本不隨溫度的變化而變化，可看作是一常數(shù).由熱力學(xué)公式[16]

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R,

(6)

ΔG=-RTlnK,

(7)

ΔS=(ΔG-ΔH)/T，

(8)

再依據(jù)EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，求得：ΔH=-20.51 KJ5mol-1，ΔS=-4.57 J5mol-1K-1.因此，EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白之間的相互作用力主要為氫鍵和范德華力.

2.6 EDTA-Fe(Ⅲ)對(duì)牛血清白蛋白構(gòu)象的影響

固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜常用于判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變.Δλ=15 nm時(shí)掃描顯示酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時(shí)掃描顯示色氨酸殘基的熒光[11].掃描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)EDTA-Fe(Ⅲ)-BSA相互作用的同步熒光光譜(見圖5)，發(fā)現(xiàn)：牛血清白蛋白的熒光主要由色氨酸殘基貢獻(xiàn)；隨著EDTA-Fe(Ⅲ)濃度的增加，酪氨酸殘基的發(fā)射波長(zhǎng)及峰型基本不變，而色氨酸殘基的發(fā)射波長(zhǎng)輕微藍(lán)移.說(shuō)明EDTA-Fe(Ⅲ)的加入使得蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的疏水性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變[17].

3 結(jié) 論

EDTA-Fe(Ⅲ)可以進(jìn)入牛血清白蛋白的疏水腔，使蛋白質(zhì)非極性區(qū)的生色基暴露于極性溶劑.EDTA-Fe(Ⅲ)對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅；EDTA-Fe(Ⅲ)與牛血清白蛋白以氫鍵和范德華力相結(jié)合，且形成了較穩(wěn)定的1∶1型復(fù)合物；EDTA-Fe(Ⅲ) 的加入使牛血清白蛋白中色氨酸殘基的疏水性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變.

a→h分別為c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0

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