有序介孔炭固相萃取-毛細(xì)管電泳聯(lián)用測(cè)定水樣中抗生素殘留*

朱華玲, 陸亞春, 王衛(wèi)平, 王愛軍, 陳建榮

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

抗生素的大量濫用不僅引起了食品安全問題，而且相當(dāng)一部分抗生素隨飼料投放、動(dòng)物糞便、醫(yī)藥廢物及降水沖刷等過程進(jìn)入水環(huán)境中，給環(huán)境安全和生態(tài)健康增加了風(fēng)險(xiǎn)[1-2].抗生素污染及其潛在的危害已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，迫切需要發(fā)展高選擇性和高靈敏度的抗生素殘留分離/富集和分析方法，提供可靠有效的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù).

固相萃取(SPE)具有富集因子高、相分離速度快、成本低、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗生素殘留分析中最常用的預(yù)富集技術(shù)[3-5].在固相萃取中，吸附劑的性能是影響富集因子和回收率的重要因素[6].因此，開發(fā)新型高效、可重復(fù)利用的SPE吸附劑，是國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者孜孜以求的目標(biāo).目前，已有很多報(bào)道基于新型材料的SPE吸附劑，如多孔共聚物[7]、分子印跡材料(MIPs)[8]、碳納米管[9]、磁性石墨烯納米粒子[10]、金屬有機(jī)骨架材料[11]等.有序介孔炭(OMC)具有比表面積高、孔徑均一、熱穩(wěn)定性好及結(jié)構(gòu)、組分和形貌多樣性等特點(diǎn)，在電化學(xué)、催化、吸附和分離等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[12-14].目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了有序介孔炭對(duì)氣體[15]和染料[16]等吸附性能的研究，但關(guān)于有序介孔炭對(duì)抗生素的吸附性能研究尚未見報(bào)道.

本文主要考察了有序介孔炭作為固相萃取吸附劑對(duì)水中四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素、土霉素和多西環(huán)素)殘留的吸附性能，通過對(duì)萃取條件和分離條件的優(yōu)化選擇，建立了固相萃取-毛細(xì)管電泳聯(lián)用測(cè)定水樣中四環(huán)素類抗生素殘留的新方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

K1060高效毛細(xì)管電泳儀(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)，熔融石英毛細(xì)管(75 μm×42 cm，有效長(zhǎng)度31 cm.河北永年銳灃色譜器件有限公司)；HGC-8型數(shù)控固相萃取儀(廣州智真生物科技有限公司)，固相萃取小柱管(北京泰樂祺科技有限公司)；Mill-Q超純水器(Millipore,Bedford,USA)；PHS-3D型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

四環(huán)素(TC)、多西環(huán)素(DC)和土霉素(OT)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京)，其分子結(jié)構(gòu)式見圖1；甲醇(色譜純)購(gòu)自金華醫(yī)藥公司；有序介孔炭購(gòu)自南京吉倉納米科技有限公司；其他試劑均為分析純；水為Mill-Q超純水.

圖1 3種四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)式

1.2 溶液配制

磷酸鹽緩沖溶液:取NaH2PO4溶液(100 mmol/L)15.00 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉鹽溶液(50 mmol/L)2.00 mL，異丙醇1.25 mL和甲醇4.00 mL，混勻，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 12.0.緩沖溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾并脫氣，待用.

準(zhǔn)確稱取抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g，用10.00 mL 0.01 mol/L HCl溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存.實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)需要將各儲(chǔ)備液混合稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液.

1.3 萃取步驟

固相萃取前，分別用5.00 mL甲醇和5.00 mL水活化裝填有一定量有序介孔炭的SPE小柱.取加標(biāo)為100 mg/L的二次水的水樣2.00 mL過柱，用V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1的混合溶液以一定的流速進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液用氮?dú)獯蹈桑玫降墓腆w物用一定量的 0.01 mol/L HCl溶液溶解.洗脫后的SPE小柱用5.00 mL甲醇和5.00 mL水沖洗再生后可循環(huán)利用.

1.4 毛細(xì)管和樣品的處理

新毛細(xì)管分別用1.0 mol/L NaOH溶液、蒸餾水和緩沖溶液沖洗10 min.每次進(jìn)樣分析前，將毛細(xì)管用1.0 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L NaOH溶液、水和緩沖溶液依次沖洗3 min.

水樣(取自金華婺江)經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用0.1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至10.0.取2.00 mL水樣按上述萃取步驟進(jìn)行萃取處理，洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯蹈珊螅玫降墓腆w物用40 μL 0.01 mol/L HCl溶液溶解.

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，選用30 mmol/L磷酸鹽(pH 12.0)作為運(yùn)行緩沖溶液.由于四環(huán)素類分子的主要環(huán)狀結(jié)構(gòu)會(huì)和多種金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)形成穩(wěn)定的螯合物，影響四環(huán)素類的測(cè)定.因此，向緩沖溶液中加入2 mmol/L EDTA二鈉鹽以避免可能存在的金屬離子的干擾.另外，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的異丙醇以改善分離度.在分離電壓為14 kV、分離溫度為25 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm的條件下，考察了該體系對(duì)上述3種抗生素分離的影響.結(jié)果表明：使用磷酸鹽體系時(shí)基線平穩(wěn)、背景吸收小，但3種抗生素仍不能實(shí)現(xiàn)基線分離.為了提高各組分間的分離度，本實(shí)驗(yàn)在運(yùn)行緩沖溶液中添加了一定量的甲醇，并考察了其對(duì)分離的影響(見圖2).圖2表明,在甲醇的體積分?jǐn)?shù)為8.0%時(shí)，各組分的遷移時(shí)間較短、分離度較好.故選擇最佳的甲醇含量為8.0%.在最佳的毛細(xì)管電泳分離條件下，3種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖3所示.

毛細(xì)管75 μm×42 cm(有效長(zhǎng)度31 cm);進(jìn)樣8 s緩沖溶液:30 mmol/L磷酸鹽,2 mmol/L EDTA二鈉鹽2.5%異丙醇,pH 12.0;電壓14 kV;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm圖2 甲醇含量對(duì)3種抗生素分離的影響

8%甲醇;毛細(xì)管75 μm×42 cm(有效長(zhǎng)度31 cm);進(jìn)樣8 s緩沖溶液:30 mmol/L磷酸鹽,2 mmol/L EDTA二鈉鹽2.5%異丙醇,pH 12.0;電壓14 kV;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm圖3 優(yōu)化條件下100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳圖譜

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 有序介孔炭的表征

在吸附測(cè)量前，將有序介孔炭在300 ℃真空環(huán)境中脫氣3 h，然后進(jìn)行N2吸附實(shí)驗(yàn)，得到的吸附等溫線和孔徑分布圖如圖4(a)所示.經(jīng)計(jì)算，有序介孔炭的比表面積SBET和總孔體積Vtotal分別為1 188.68 m2/g和1.51 cm3/g，平均孔徑為3.64 nm.按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)分類法，圖4(a)表明其N2吸附等溫線屬于Ⅳ型，證明介孔炭是2-D六邊形的有序結(jié)構(gòu)[18].同時(shí)，小角散射X射線衍射(XRD)圖(見圖4(b))顯示，在0°～10°出現(xiàn)單峰，表明該材料是高度有序性的介孔材料[18].

(a)N2吸附等溫線和孔徑分布圖 (b)小角度XRD圖 圖4 有序介孔炭的N2吸附等溫線、孔徑分布圖及小角度X射線衍射圖譜

2.2.2 洗脫劑的影響

分別考察了V(甲醇)∶V(乙腈)為1∶1，V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)為1∶1，甲醇-鹽酸(cHCl=1×10-3mol/L)和甲醇-乙酸(cHAc=1×10-3mol/L)等洗脫液對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果如圖5所示.從圖5可以看出，使用甲醇/乙腈(ACN)混合溶劑作為洗脫液時(shí)，各組分可得到相對(duì)較大的峰面積.因此，選擇甲醇/乙腈混合溶劑為洗脫劑.

2.2.3 有序介孔炭的質(zhì)量的影響

有序介孔炭擁有開孔狀結(jié)構(gòu)、比表面積大和吸附能力強(qiáng)的特性，能與四環(huán)素類抗生素發(fā)生非共價(jià)的相互作用.本實(shí)驗(yàn)考察了有序介孔炭的質(zhì)量分別為1，5，10，20 mg時(shí)各組分的萃取效率(見圖6).從圖6可以看出，當(dāng)有序介孔炭的質(zhì)量增加到5 mg時(shí)，四環(huán)素和多西環(huán)素的峰面積迅速增大；當(dāng)有序介孔炭的質(zhì)量大于5 mg時(shí)，四環(huán)素、土霉素和多西環(huán)素的峰面積反而逐漸減小.因此，選擇有序介孔炭的質(zhì)量為5 mg.

2.2.4 洗脫液體積和洗脫速度的影響

本實(shí)驗(yàn)分別考察了洗脫液體積為2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL時(shí)各組分的洗脫效率.結(jié)果表明:隨著洗脫液體積的增大，各組分的峰面積逐漸增加；當(dāng)洗脫液體積大于4.00 mL時(shí)，各組分的峰面積趨于穩(wěn)定.因此，確定洗脫液用量為4.00 mL.

本實(shí)驗(yàn)還考察了洗脫速度在0.2～1.0 mL/min時(shí)各組分的峰面積的變化情況.結(jié)果表明，當(dāng)洗脫速度為0.2～0.5 mL/min時(shí)，峰面積較大，但洗脫速度慢,消耗時(shí)間長(zhǎng).綜合考慮峰面積和分析時(shí)間，選擇洗脫速度0.7 mL/min為最佳洗脫速度.

m(OMC)為5 mg;V(洗脫液)為5 mL流速為0.5 mL/min;pH 4.7圖5 洗脫劑對(duì)萃取效率的影響

洗脫劑V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1V(洗脫液)為5 mL;流速為0.5 mL/min;pH 4.7圖6 有序介孔炭的質(zhì)量對(duì)萃取效率的影響

洗脫劑V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1;m(OMC)為5 mgV(洗脫液)為4 mL;流速為0.7 mL/min圖7 pH對(duì)萃取效率的影響

2.2.5 樣品溶液pH的影響

四環(huán)素類抗生素分子中含有多個(gè)羥基，其在水溶液中的pKa1,pKa2和pKa3值分別為3.3，7.5和9.0左右[19]，因此，溶液的酸度會(huì)影響四環(huán)素類抗生素的離子化程度.本實(shí)驗(yàn)考察了樣品溶液pH值為4.0～12.0時(shí)對(duì)各組分萃取效果的影響.從圖 7可以看出:在pH 4.0～10.0時(shí)，隨著pH值的增大，各組分的峰面積呈增加的趨勢(shì)，說明有序介孔炭對(duì)抗生素去質(zhì)子化形式的親和力比質(zhì)子化的強(qiáng);當(dāng)pH大于10.0時(shí)，各組分的萃取效果呈下降的趨勢(shì)，可能是由于有序介孔炭吸附的目標(biāo)分子帶有較多的負(fù)電荷，使得吸附劑和未被吸附的抗生素之間存在靜電排斥作用.因此，選擇最佳的樣品溶液pH值為10.0.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 工作曲線的繪制

取一系列質(zhì)量濃度為3 000,5 000,7 000,9 000,11 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在最佳萃取和分離條件下，按上述萃取步驟進(jìn)行富集和分析測(cè)定.以峰面積為縱坐標(biāo)y、樣品質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)x繪制工作曲線,以信噪比為3∶1計(jì)算檢出限.3種抗生素測(cè)定的相關(guān)系數(shù)、回歸方程及檢出限見表1.

表1 3種抗生素的回歸結(jié)果和檢出限

2.3.2 樣品分析

水樣按前述方法處理后，在最佳萃取和分離條件下進(jìn)行富集和分析測(cè)定.結(jié)果表明，水樣中未檢出抗生素殘留.在水樣中分別加入4 000和6 000 μg/L的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平下平行測(cè)定3次，分別計(jì)算加標(biāo)樣品的回收率及精密度，結(jié)果見表2.圖8為水樣加標(biāo)前后的毛細(xì)管電泳譜圖.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已報(bào)道的富集和檢測(cè)四環(huán)素類抗生素的文獻(xiàn)比較,結(jié)果如表3所示.由表3可以看出，以有序介孔炭為吸附劑，除四環(huán)素外，土霉素和多西環(huán)素的回收率高于強(qiáng)陰離子交換柱(SAX)和親水親脂萃取柱(HLB).

表2 樣品的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)

注：nd為未檢測(cè)到.

表3 與其他固相萃取方法比較

注：1)SPE-HPLC：固相萃取-高效液相色譜法；2)SPE-LC-MS/MS：固相萃取-超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；3)SPE-CE：固相萃取-毛細(xì)管電泳；4)SPE-HILIC：固相萃取-親水作用色譜法.

A:加標(biāo)前;B加標(biāo)后圖8 水樣加標(biāo)前后的電泳圖譜

3 結(jié) 論

本文采用有序介孔炭作為固相萃取吸附劑預(yù)富集地表水中殘留的四環(huán)素類抗生素，再結(jié)合毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析檢測(cè).有序介孔炭擁有開孔狀結(jié)構(gòu)、比表面積大和吸附能力強(qiáng)的特性，并且與四環(huán)素類抗生素能發(fā)生非共價(jià)的相互作用，因此對(duì)四環(huán)素類抗生素有很好的預(yù)富集效果.除四環(huán)素外，其余2種抗生素的回收率介于89.0%～119.6%.結(jié)果表明，有序介孔炭作為吸附劑的固相萃取小柱的吸附能力較好.因此，有序介孔炭是一種預(yù)富集地表水中土霉素和多西環(huán)素殘留的高效吸附材料.

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