急性髓系白血病CTNNA1基因的表達(dá)及臨床意義

陳星星，錢(qián)軍，林江，安翠，馬吉春，鄧兆群，陳芹，楊靜，李云，錢(qián)震，劉清，唐春艷

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.血液科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

急性髓系白血病CTNNA1基因的表達(dá)及臨床意義

陳星星1，錢(qián)軍1，林江2，安翠1，馬吉春2，鄧兆群2，陳芹2，楊靜1，李云1，錢(qián)震1，劉清1，唐春艷1

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.血液科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：研究急性髓系白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）患者鈣黏蛋白相關(guān)蛋白（α-catenin，CTNNA1）基因的表達(dá)情況并探討其臨床意義。方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)25例非惡性血液病患者（對(duì)照組）和92例初診AML患者（觀察組）中CTNNA1基因的表達(dá)水平，并分析其與臨床參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：觀察組中51例（51／92，55.43%）存在CTNNA1低表達(dá)，而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)CTNNA1低表達(dá)（0.00%），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝17.152，P＜0.001）；CTNNA1表達(dá)水平與AML患者的年齡、性別、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、FAB分型、核型分組之間均無(wú)相關(guān)性（P均＞0.05）。ROC曲線分析表明CTNNA1表達(dá)水平能有效鑒別觀察組和對(duì)照組，AUC＝0.806。觀察組中CTNNA1低表達(dá)的患者化療后完全緩解率高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.476，P＝0.142）。4例初診AML患者在獲得完全緩解后CTNNA1表達(dá)水平均較治療前有所升高。結(jié)論：CTNNA1基因低表達(dá)可能是AML中的一個(gè)常見(jiàn)分子事件，檢測(cè)其表達(dá)可用于AML患者的輔助診斷和疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)。

鈣黏蛋白相關(guān)蛋白；急性髓系白血?。换虮磉_(dá)

連環(huán)素是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞黏附功能并作為與細(xì)胞骨架微絲蛋白相連接的一組黏附分子，主要有α、β及γ3種［1］，尤其是鈣黏蛋白相關(guān)蛋白（α-catenin，CTNNA1）被認(rèn)為是連接E-表皮鈣黏蛋白-β-連環(huán)素復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白纖維的重要蛋白［1－2］。CTNNA1表達(dá)的下調(diào)或缺失可導(dǎo)致表皮鈣黏蛋白復(fù)合體（E-cd／cat）功能失調(diào)［3］，從而使細(xì)胞間的接觸抑制喪失，腫瘤細(xì)胞無(wú)限制地增生，失去分化能力，細(xì)胞間連接松散易于從局部脫落，且侵襲能力較強(qiáng)，極易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［4］。CTNNA1基因位于染色體5q31，其編碼的蛋白在正常組織中普遍表達(dá)［5］，而在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)［6］。因此，我們擬應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）研究急性髓系白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）患者CTNNA1基因的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2005年10月至2011年10月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院住院治療的92例AML初診患者，作為觀察組。其中，男55例，女37例，年齡9～87歲（中位53歲）。臨床診斷按照FAB和WHO 2008版標(biāo)準(zhǔn)（原始細(xì)胞≥20%）［7］。核型分析應(yīng)用常規(guī)R顯帶技術(shù)，核型分組按照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。另選擇非惡性血液病患者25例作為對(duì)照組，包括正常健康者5例，特發(fā)性血小板紫癜2例和缺鐵性貧血18例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與RNA制備 全部患者均于初診時(shí)抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)RNA濃度及純度（D260／D280比值在1.8～2.0之間），－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 2.0μg總RNA經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，總體系40μL，其中含200 U反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV，MBI Fermentas，美國(guó)）、0.5 mmol／L dNTPs、10 mmol／L還原劑（DTT）、25 U RNA酶抑制劑。反應(yīng)條件為25℃10 min，42℃60 min。cDNA于－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qRT-PCR 引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0軟件，CTNNA1引物序列：上游5′-ATGCCATAATCAGAACAC-3′，下游5′-ACTGCCTTAGCAAACAC-3′，擴(kuò)增片段為146 bp；內(nèi)參為ABL管家基因，引物序列：上游5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。25μL PCR反應(yīng)體系包括1×緩沖液，dNTP 0.2 mmol／L，MgCl24 mmol／L，上下游引物0.4μmol／L，熒光染料（20× EvaGreen），熒光定量PCR參比染料（50×Rox），1.0 U Taq DNA聚合酶（MBIFermentas，USA）和50 ng cDNA。反應(yīng)在ABI7300擴(kuò)增儀（ABI公司）上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，80℃收集熒光30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)?5℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，60℃15 s。每次擴(kuò)增均以重組CTNNA1質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以雙蒸水作為無(wú)模板對(duì)照（NTC）。熔解曲線揭示PCR產(chǎn)物為單一峰，2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度正確。隨機(jī)選取2例PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序證實(shí)序列正確。

1.2.4 陽(yáng)性模板及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 內(nèi)參ABL及CTNNA1表達(dá)的引物序列同上，將1例AML患者的ABL及CTNNA1表達(dá)的定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PGEM-T載體，擴(kuò)增后純化回收，連接過(guò)夜后重組載體，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定（上海生工生物工程公司）完全正確，分別將其定量；從108拷貝／μL開(kāi)始進(jìn)行10倍稀釋，建立陽(yáng)性模板梯度后分別進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，繪制陽(yáng)模標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取CTNNA1與ABL表達(dá)ΔCT值最小的1例對(duì)照標(biāo)本作為對(duì)照。CTNNA1基因表達(dá)采用如下公式：NCTNNA1＝（E）ΔCT CTNNA1（對(duì)照－標(biāo)本）／（E）ΔCT ABL（對(duì)照－標(biāo)本）；

CTNNA1 ABL PCR擴(kuò)增效率E＝10（－1／斜率）；ΔCT指對(duì)照與標(biāo)本之間CTNNA1和ABL循環(huán)閾值（CT）值的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料之間的差異分析采用Kruskal-Wallis（多組間比較）或Mann-Whitney U檢驗(yàn)（兩組比較），計(jì)數(shù)資料的差異分析采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；CTNNA1表達(dá)與臨床資料之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩和檢驗(yàn)；生存時(shí)間分析采用Kaplan-Meier法；CTNNA1表達(dá)在AML中的診斷價(jià)值采用接收者操作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲線及曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）進(jìn)行評(píng)價(jià)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTNNA1基因的表達(dá)

對(duì)照組中CTNNA1的表達(dá)水平為0.28～4.16（1.34±1.01）；因此，以NCTNNA1＜0.33為依據(jù)判斷AML患者中CTNNA1為低表達(dá)，AML患者中CTNNA1表達(dá)水平為0.00～8.21（0.65±1.24），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組和觀察組中CTNNA1低表達(dá)陽(yáng)性率分別為0.00%（0／25）和55.43%（51／92），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝17.152，P＜0.001）。

2.2 CTNNA1基因的表達(dá)與臨床參數(shù)相關(guān)性

CTNNA1表達(dá)水平與AML患者的年齡、性別、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、FAB分型及不同核型分組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 AM L患者的CTNNA1表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 CTNNA1表達(dá)與AML患者預(yù)后之間的關(guān)系

結(jié)果顯示，觀察組中CTNNA1低表達(dá)患者化療后的完全緩解率（63%）高于對(duì)照組患者（46%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.476，P＝0.142）。73例患者具有隨訪資料，CTNNA1低表達(dá)與CTNNA1正常表達(dá)兩組患者的總體生存時(shí)間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.003，P＝0.960）。見(jiàn)圖1。

2.4 CTNNA1表達(dá)作為診斷標(biāo)志的意義

應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)CTNNA1表達(dá)水平能否作為AML患者輔助診斷的一個(gè)潛在標(biāo)志，結(jié)果顯示，CTNNA1表達(dá)水平能有效鑒別觀察組AML患者和對(duì)照組患者，AUC＝0.806（95%可信區(qū)間為0.723～0.890）（圖2）。在CTNNA1表達(dá)水平為0.11時(shí)，診斷AML的敏感性和特異性分別為71%和100%。

2.5 CTNNA1表達(dá)在AML隨訪中的意義

對(duì)CTNNA1表達(dá)水平較低的4例初診AML患者的骨髓標(biāo)本進(jìn)行治療前后的檢測(cè)，結(jié)果顯示，患者病情獲得完全緩解后的CTNNA1表達(dá)水平較治療前均有所升高。見(jiàn)圖3。

圖1 AM L患者的總體生存時(shí)間分析

圖2 CTNNA1表達(dá)水平輔助診斷AM L的ROC曲線

3 討論

研究揭示，多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中存在著CTNNA1基因突變或表達(dá)下調(diào)，且與患者的疾病進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)［9－11］；CTNNA1表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞黏附能力下降，促進(jìn)腫瘤形成［12］。另有研究指出，白血病干細(xì)胞中也存在著CTNNA1表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)改變受啟動(dòng)子甲基化和組蛋白去乙?；{(diào)控［13］。CTNNA1轉(zhuǎn)染則可抑制白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡［13］，而PTEN-C／EBPα-CTNNA1保守軸在CTNNA1表達(dá)調(diào)控中同樣發(fā)揮著重要作用，CTNNA1表達(dá)下調(diào)的原代白血病細(xì)胞中存在著人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）或C／EBPα基因突變［6］；Ye等［14］發(fā)現(xiàn)CTNNA1啟動(dòng)子甲基化與骨髓增生異常綜合征疾病進(jìn)展相關(guān)，但迄今為止對(duì)中國(guó)人群CTNNA1表達(dá)與AML患者臨床意義的研究尚不清楚。

本研究結(jié)果表明，CTNNA1表達(dá)降低在AML患者中發(fā)生頻率較高，但與AML亞型和血液學(xué)參數(shù)并無(wú)相關(guān)性，且對(duì)患者的化療效果和預(yù)后并無(wú)影響，提示CTNNA1異?？赡苁前籽“l(fā)生過(guò)程中的一個(gè)較早期事件。本研究未能發(fā)現(xiàn)CTNNA1表達(dá)與5q-的相關(guān)性，可能一方面由于本組中伴5q-異常的病例數(shù)較少，另一方面可能由于CTNNA1表達(dá)改變還受啟動(dòng)子甲基化和組蛋白去乙酰化調(diào)控有關(guān)，這需要更多的病例進(jìn)一步明確。ROC曲線分析顯示，CTNNA1表達(dá)水平診斷AML的AUC為0.806，當(dāng)診斷臨界值設(shè)為0.11時(shí)其特異性達(dá)100%，敏感性達(dá)71%，表明CTNNA1表達(dá)對(duì)于AML具有中等診斷價(jià)值。同時(shí)，我們對(duì)4例AML患者進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)緩解后CTNNA1表達(dá)水平較治療前明顯上升，提示CTNNA1表達(dá)可作為一個(gè)分子標(biāo)志用于疾病狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。

綜上所述，我們的研究揭示AML患者中存在著較高頻率的CTNNA1表達(dá)下調(diào)，但其對(duì)患者的治療效果及預(yù)后并無(wú)明顯影響；檢測(cè)CTNNA1表達(dá)可用于AML患者的輔助診斷和疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)。

［1］Ozawa M，Baribault H，Kemler R.The cytoplasmic domain of the cell adhesionmolecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species［J］.EMBO J，1989，8（6）：1711－1717.

［2］Cavey M，Rauzi M，Lenne PF，et al.A two-tiered mechanism for stabilization and immobilization of E-cadherin［J］.Nature，2008，453（7196）：751－756.

［3］Kobielak A，F(xiàn)uchs E.Alpha-catenin：at the junction of intercellular adhesion and actin dynamics［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5（8）：614－625.

［4］Takeda H，Nagafuchi A，Yonemura S，et al.V-src kinase shifts the cadherin-based cell adhesion from the strong to the weak state and beta catenin is not required for the shift［J］.J Cell Biol，1995，131（6 Pt 2）：1839－1847.

［5］Furukawa Y，Nakatsuru S，Nagafuchi A，et al.Structure，expression and chromosome assignment of the human catenin（cadherin-associated protein）alpha 1 gene（CTNNA1）［J］.Cytogenet Cell Genet，1994，65（1／2）：74－78.

［6］Fu CT，Zhu KY，Mi JQ，et al.An evolutionarily conserved PTEN-C／EBP-CTNNA1 axis controlsmyeloid development and transformation［J］.Blood，2010，115（23）：4715－4724.

［7］Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，etal.WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues［M］.Lyon：IARC Press，2008.

［8］Slovak ML，Kopecky KJ，Cassileth PA，et al.Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia：a Southwest Oncology Group／Eastern Cooperative Oncology Group Study［J］.Blood，2000，96（13）：4075－4083.

［9］Morton RA，Ewing CM，Nagafuchi A，et al.Reduction of E-cadherin levels and deletion of the alpha-catenin gene in human prostate cancer cells［J］.Cancer Res，1993，53（15）：3585－3590.

［10］Shibata H，Takano H，Ito M，etal.Alpha-catenin is essential in intestinal adenoma formation［J］.PNAS，2007，104（46）：199－204.

［11］Morrogh M，Andrade VP，Giri D，et al.Cadherin-catenin complex dissociation in lobular neoplasia of the breast［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，132（2）：641－652.

［12］Ding L，Ellis MJ，Li S，et al.Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft［J］.Nature，2010，464（7291）：999－1005.

［13］Liu TX，Becker MW，Jelinek J，et al.Chromosome 5q deletion and epigenetic suppression of the gene encoding α-catenin（CTNNA1）in myeloid cell transformation［J］.NatMed，2007，13（1）：78－83.

［14］Ye Y，McDevitt MA，Guo M，et al.Progressive chromatin repression and promoter methylation of CTNNA1 associated with advanced myeloid malignancies［J］.Cancer Res，2009，69（21）：8482－8490.

Expression of CTNNA1 gene in acutem yeloid leukem ia and its clinical significance

CHEN Xing-xing1，QIAN Jun1，LIN Jiang2，AN Cui1，MA Ji-chun2，DENG Zhao-qun2，CHEN Qin2，YANG Jing1，LIYun1，QIAN Zhen1，LIU Qing1，TANG Chun-yan1

（1.Department of Hematology，2.Department of Laboratory Center，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the expression of the human catenin alpha 1（CTNNA1）gene in acutemyeloid leukemia（AML）and its clinical significances.M ethods：The expression of CTNNA1 transcript in bonemarrow mononuclear cells from 25 controls（control group）and 92 newly diagnosed AML patients（observation group）were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）；and the relationship between CTNNA1 expression and clinical parameters were analyzed.Results：Downregulated CTNNA1 expression was found in 51 AML cases（55.43%），significantly lower than that in all25 controls（P＜0.001）.There was no correlation between The CTNNA1 expression level and the sex，age，blood parameters and FAB subtypes（both P＞0.05）.ROC curve analysis revealed that the CTNNA1 expression level could discriminate AML patients from controls effectively（AUC＝0.806）.There was no statistical difference in the complete remission rate between control group and observation group，though the patients with low CTNNA1 expression in observation group had higher complete remission rate after chemotherapy（χ2＝2.476，P＝0.142）.The CTNNA1 expression levels of four patients in the observation group all increased after complete remission.Conclusion：The decreased-expression of CTNNA1 genemay be a commonmolecular e-vent in AML；and detecting its expression could be used for auxiliary diagnosis and monitoring disease.

CTNNA1；acutemyeloid leukemia；gene expression

R733.71

A

1671－7783（2014）01－0052－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130152

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270630，81172592）；江蘇省科技廳臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)課題（BL2012056）；江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目資助計(jì)劃（BRA2011085）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX12＿0673）；鎮(zhèn)江市科技基礎(chǔ)設(shè)施計(jì)劃項(xiàng)目（SS2012003）；鎮(zhèn)江市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才、鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2011056）

陳星星（1989—），女，碩士研究生；錢(qián)軍（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：qianjun0007＠sina.com

2013－07－06 ［編輯］劉星星