不同劑量N-亞硝基雙-2-氧丙基誘導(dǎo)倉(cāng)鼠胰腺癌的成模效果及對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

曹維 周國(guó)雄 張海峰 丁曉凌 潘嶸嶸 瞿利帥 張弘 徐正府

自1974年P(guān)our等采用N-亞硝基雙-2-氧丙基(N-nitrosobis-2-oxopropylamin, BOP)成功誘導(dǎo)黃金倉(cāng)鼠胰腺癌模型以來，各國(guó)學(xué)者已構(gòu)建了多種胰腺癌動(dòng)物模型，它們有其各自的優(yōu)劣性，在臨床科研應(yīng)用中有不同用途[1-4]。由于倉(cāng)鼠胰腺癌發(fā)病機(jī)制中K-ras基因點(diǎn)突變和5′CpG異常甲基化引起的p16滅活與人胰腺癌的發(fā)病機(jī)制相似，因此采用BOP制備的倉(cāng)鼠胰腺癌模型是一個(gè)理想的動(dòng)物模型。但研究發(fā)現(xiàn)，BOP誘導(dǎo)倉(cāng)鼠腫瘤模型因誘導(dǎo)劑量和時(shí)間的差異而出現(xiàn)不同的結(jié)果[5]。為此，本研究采用不同時(shí)間、不同劑量BOP誘導(dǎo)倉(cāng)鼠，觀察其造模效果及對(duì)相關(guān)基因GAL-1、GAL-3、COX-2、5-LOX、MHC表達(dá)的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

敘利亞黃金倉(cāng)鼠，6～8周齡，雌性，體質(zhì)量80 g左右，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。BOP購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，Trazol購(gòu)自invitrogen公司，實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自fermentas公司，抗COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

二、倉(cāng)鼠胰腺癌模型的構(gòu)建

取72只倉(cāng)鼠，按完全隨機(jī)法分為A、B、C 組，每組24只。A組采用小劑量、長(zhǎng)周期BOP造模，即皮下注射BOP 10 mg/kg體質(zhì)量，每周1次，連續(xù)8周，36周成模后處死；B組采用大劑量、短周期BOP造模，即首次皮下注射BOP 70 mg/kg體質(zhì)量，1周后皮下注射BOP 20 mg/kg體質(zhì)量,每周1次，連續(xù)3周，20周成模后處死；C組為未注射BOP的對(duì)照組，飼養(yǎng)36周處死。取胰腺組織及肝臟組織行病理組織學(xué)檢查。

三、COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)各基因全長(zhǎng)cDNA序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，再經(jīng)過Blast進(jìn)行同源性檢索后，由上海invitrogen公司合成引物，以β-actin為內(nèi)參。引物序列見表1。取新鮮胰腺癌組織，應(yīng)用Trazol提取總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再行PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量，以對(duì)照組的mRNA表達(dá)量為1計(jì)算表達(dá)的倍數(shù)。

表1 COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHCⅡ以及β-actin的引物序列

四、5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)量。取新鮮胰腺癌組織制備組織勻漿，蛋白定量后取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法，以β-actin為內(nèi)參。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影。采用美國(guó)Biorad公司Quantity One 4.0圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

另外，采用免疫組織熒光法檢測(cè)5-LOX、COX-2、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達(dá)。新鮮胰腺癌組織行冷凍切片，4℃丙酮固定10 min，PBS洗滌后用3%過氧化氫孵育5～10 min，PBS再次洗滌后用5%～10%正常山羊血清室溫封閉10 min，傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育1～2 h或4℃過夜,PBS沖洗后滴加適當(dāng)比例稀釋的TRITC標(biāo)記二抗37℃孵育10～30 min，熒光顯微鏡下觀察。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、倉(cāng)鼠造模效果

A組24只倉(cāng)鼠中19只肉眼發(fā)現(xiàn)胰腺頭部有暗紅色硬結(jié)節(jié)樣瘤體形成，質(zhì)地堅(jiān)硬，部分表面凹凸不平，可見營(yíng)養(yǎng)血管。光鏡下見胰腺癌細(xì)胞呈實(shí)性團(tuán)塊或巢狀、條索狀排列，間隔以少量間質(zhì)，可見腫瘤血管；細(xì)胞明顯異型，核大深染，核分裂象多見，可見明顯核仁，部分可見變性壞死現(xiàn)象(圖1)。誘導(dǎo)胰腺癌的成功率達(dá)79.2%。其他臟器未見異常。

圖1 對(duì)照組(a)、A組(b)倉(cāng)鼠胰腺組織病理改變 (HE ×400)

B組24只倉(cāng)鼠胰腺均未見異常，但18只倉(cāng)鼠見肝臟表面有大小不等，高低不平的灰色結(jié)節(jié)，色澤灰暗，質(zhì)地堅(jiān)韌。光鏡下見肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞呈實(shí)性團(tuán)塊或巢狀、條索狀排列，間隔以少量間質(zhì)，可見腫瘤血管；細(xì)胞明顯異型，核大深染，核分裂象多見，可見明顯核仁，部分可見變性壞死現(xiàn)象(圖2)。誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管癌的成功率達(dá)75.0%。其他臟器未見異常。

圖2 對(duì)照組(a)、B組(b)倉(cāng)鼠肝組織病理改變 (HE ×400)

二、倉(cāng)鼠胰腺癌組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)

A組倉(cāng)鼠胰腺組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mRNA的表達(dá)量分別為8.78±0.25、8.51±0.20、25.28±0.61、13.10±0.68、12.40±0.46和5.08±0.20，對(duì)照組胰腺組織分別為17.45±0.81、16.74±0.26、39.73±0.51、76.53±0.97、43.88±0.31和4.50±0.46，A組的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.93、2.03、1.57、5.55、3.54和0.92倍，除MHC-ⅡmRNA外，其余5個(gè)基因的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.53、27.31、19.30、23.64、25.66，P值均<0.05)。

三、倉(cāng)鼠胰腺癌組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達(dá)

A組倉(cāng)鼠胰腺癌組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白的表達(dá)量分別為2.47±0.22、0.56±0.05、1.23±0.05、1.55±0.13、2.02±0.01和0.19±0.01，對(duì)照組倉(cāng)鼠正常胰腺組織的表達(dá)量分別為0.80±0.08、0.39±0.01、0.60±0.01、0.53±0.03、0.40±0.02和0.20±0.01，胰腺癌組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC-Ⅰ蛋白的表達(dá)較正常胰腺組織顯著增強(qiáng)(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為 19.44、4.85、16.53、12.13、39.68，P值均<0.05)。胰腺癌組織MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)與正常胰腺組織的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組織熒光測(cè)定的結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果一致(圖4)。

圖3 對(duì)照組、A組倉(cāng)鼠胰腺組織的蛋白表達(dá)

討 論

亞硝基復(fù)合物是對(duì)嚙齒類動(dòng)物最有效的致癌劑，誘導(dǎo)胰腺癌的成功率高，為研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，評(píng)估藥物及其他治療對(duì)胰腺癌的預(yù)防及療效提供了理想的模型。但缺點(diǎn)是造模周期長(zhǎng)，且亞硝基復(fù)合物缺乏對(duì)胰腺的特異性，在誘導(dǎo)胰腺癌的同時(shí)容易造成其他臟器的腫瘤。

有關(guān)BOP誘導(dǎo)造模的實(shí)驗(yàn)方法大致可分為小劑量長(zhǎng)周期倉(cāng)鼠皮下注射以及大劑量短周期倉(cāng)鼠皮下注射兩種。吳澤珊等[5]報(bào)道，BOP小劑量長(zhǎng)周期皮下注射能成功誘導(dǎo)倉(cāng)鼠胰腺癌模型，且成功率較高，但BOP大劑量短周期皮下注射未能誘導(dǎo)胰腺癌，卻誘導(dǎo)出肝內(nèi)膽管癌。本研究采用上述兩種方法造模，結(jié)果同文獻(xiàn)報(bào)道一致。倉(cāng)鼠皮下注射BOP能誘導(dǎo)出不同的腫瘤模型，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

近年來的文獻(xiàn)報(bào)道，GAL-1和GAL-3在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，如肝癌、胃癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌，胰腺癌等，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中所起的作用正日益受到關(guān)注[6-10]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[11]結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1和AsPC-1均有GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。胰腺癌組織亦均有GAL-1、GAL-3基因的表達(dá)，且GAL-1在胰腺癌組織中的表達(dá)和胰腺癌的分化程度相關(guān)，在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[11]。而正常胰腺組織無GAL-1、GAL-3基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，倉(cāng)鼠胰腺癌組織的GAL-1、GAL-3 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)。因此，倉(cāng)鼠胰腺癌模型的建立為今后研究GAL-1和GAL-3在人胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 對(duì)照組(左)和胰腺癌組(右)胰腺組織COX-2(a)、5-LOX(b)、GAL-1(c)、GAL-3(d)、MHC-Ⅰ(e)、MHC-Ⅱ(f)的表達(dá)(免疫熒光 ×400)

近年來大量研究證實(shí)，脂氧合酶和環(huán)氧合酶中的5-LOX和COX-2除了在炎癥中發(fā)揮重要作用外，還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，因此，5-LOX和COX-2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用正日益受到關(guān)注[12-15]。研究表明,5-LOX在多種胰腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，而在正常人胰腺細(xì)胞中無表達(dá)，抑制5-LOX的表達(dá)可能有助于胰腺癌的治療[16-17]。本研究結(jié)果顯示，倉(cāng)鼠胰腺癌組織COX-2、5-LOX的表達(dá)增強(qiáng)，提示倉(cāng)鼠胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與花生四烯酸的代謝也有著密切關(guān)系。因此構(gòu)建倉(cāng)鼠胰腺癌模型對(duì)進(jìn)一步研究通過抑制兩條代謝途徑靶向治療胰腺癌提供了很好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究前期結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1低表達(dá)MHC-Ⅱ類分子以及共刺激分子是免疫逃逸的重要機(jī)制之一。CIITA因子表達(dá)陰性是胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1不能表達(dá)MHC-Ⅱ類分子基因的關(guān)鍵原因。采用組蛋白去乙?；敢种苿┖图谆D(zhuǎn)移酶抑制劑表觀遺傳處理后，CIITA基因Ⅳ型啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化程度降低，CIITA蛋白重新表達(dá)，上調(diào)MHC-Ⅰ類、Ⅱ類分子和免疫共刺激因子CD40、CD80的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，倉(cāng)鼠胰腺癌組織MHC-Ⅰ表達(dá)增強(qiáng)，而MHC-Ⅱ表達(dá)無明顯變化，提示倉(cāng)鼠胰腺癌與人胰腺癌類似，同樣存在免疫逃逸現(xiàn)象，對(duì)研究其抗胰腺癌的免疫治療有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Shafer-Weaver K, Anderson M, Malyguine A, et al.T cell tolerance to tumors and cancer immunotherapy[J].Adv Exp Med Biol, 2007, 601:357-368.

[2] Poch B, Lotspeich E, Ramadani M, et al. Systemic immune dysfunction in pancreatic cancer patients[J]. Langenbecks Arch Surg, 2007, 392(3): 353-358.

[3] Dannull J，Su Z，Rizzieri D，et al．Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after depletion of regulatory T cells[J].J Clin Invest,2005，115(12)：3623-3633.

[4] Qin H，Zhou C，Wang D，et al．Specific antitumor immune response induced by a novel DNA vaccine composed of multilple CTL and T helper cell epitopes of prostate cancer associated antigens[J]．Immunol Lett，2005, 99(1)：85-93.

[5] 吳澤珊，蒲宇，沈成義，等.大劑量BOP[N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺]誘導(dǎo)了金黃地鼠肝內(nèi)膽管癌而非胰腺癌[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,26(2)：115-118.

[6] Stockinger B，Bourgenois C，Kassiotis G．CD4+memory T cells：functional differentiation and homeostasis[J]．Immunol Rev，2006，211：39-48.

[7] Onoe K，Yanagawa Y，Minam K，et al．Thl or Th2 balance regulated by interation between dendritic cells and NKT cells[J]．Immunol Res，2007，38(1-3)：319-332.

[8] Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties[J].Annu Rev Immunol, 1989, 7:145-173.

[9] Yamamura M,Modlin RL,Ohmen JD,et al. Local expression of anti-inflammatory cytokines in cancer[J]．J Clin Invest,1993,91(3)：1005-1010.

[10] Kharkevitch DD，Seito D,Balch GC，et al．Characterization of autologous tumor-specific T-helper 2 cells in tumor-infiltrating lymphocytes from a patient with metastatic melanoma[J]．Int J Cancer,1994,58(3)：317-323.

[11] 周國(guó)雄，張淼，丁曉凌，等.半乳凝素3在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].中華胰腺病雜志，2012,12(5)：320-322.

[12] Bellone G, Smirne C, Mauri FA, et al. Cytokine expression profile in human pancreatic carcinoma cells and in surgical pecimens: implications for survival[J]. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55(6): 684-698.

[13] Shevach E, Davidson T, Huter E, et al. Role of TGF-beta in the induction of Foxp3 expression and T regulatory cell function[J]. J Clin Immunol, 2008, 28(6): 640-646.

[14] Terabe M, Matsui S, Park JM, et al. Transforming growth factor-beta production and myeloid cells are an effector mechanism through which CD1d-restricted T cells block cytotoxic Tlymphocyte-mediated tumor immunosurveillance: abrogation prevents tumor recurrence[J]. J Exp Med, 2003, 198(11): 1741-1752.

[15] Cao W, Zhou GX, Qiu J, et al. Research on the epigenetic modification of pancreatic cancer vaccine[J]. Hepatogastroen-terology, 2014, 61(130):272-277.

[16] Wenger FA, Jacobi CA, Kilian M, et al. The impact of laparoscopic biopsy of pancreatic lymph nodes with helium and carbon dioxide on port site and liver metastasis in BOP-induced pancreatic cancer in hamster[J]. Clin Exp Metastasis, 2000,18(1):11-14.

[17] van Kouwen MC, Laverman P, van Krieken JH, et al. FDG-PET in the detection of early pancreatic cancer in a BOP hamster model[J]. Nucl Med Biol, 2005,32(5):445-450.