聚酰胺固相萃取－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中的6種全氟化合物

林 欽， 付鳳富， 陳國(guó)南， 鄭小嚴(yán)， 戴 明

（1.福州大學(xué)食品安全分析與檢測(cè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350116；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州350002）

近年來(lái)，全氟化合物（PFCs）的殘留問(wèn)題越來(lái)越引起全球的關(guān)注，原因是全氟化合物在環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，難以降解；大量的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）被認(rèn)為是一類具有神經(jīng)毒性［1］、肝臟毒性［2］等全身多臟器毒性的環(huán)境污染物。目前，國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于全氟化合物對(duì)環(huán)境的污染情況［3］及檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道［4，5］，檢測(cè)方法主要采用了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)［6－12］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［13］、氣相色譜法［14］和高效液相色譜／四極桿－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法［15］等。迄今為止，我國(guó)已發(fā)布了多個(gè)針對(duì)食品包裝材料、食品接觸材料和化工產(chǎn)品等的PFOA、PFOS殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［16－18］。由于全氟化合物的高穩(wěn)定性，它們被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)涂料、裝潢材料、塑料、包裝材料等，因此，環(huán)境中普遍存在著全氟化合物的污染，并通過(guò)食物鏈傳導(dǎo)到生物體。飼料生產(chǎn)中大量使用到魚(yú)粉和油脂等原料，這些都有可能受到全氟化合物的污染，所以，有必要加強(qiáng)對(duì)飼料中全氟化合物含量的監(jiān)測(cè)。目前已見(jiàn)采用液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源食品、食品接觸材料、土壤、底泥和活性污泥、環(huán)境水、紡織品與飲用水中的全氟化合物，尚未見(jiàn)對(duì)飼料產(chǎn)品中全氟化合物殘留的分析方法研究報(bào)道。迄今為止，國(guó)際、國(guó)內(nèi)尚未出臺(tái)飼料中全氟化合物測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，開(kāi)展飼料中全氟化合物殘留的檢測(cè)技術(shù)研究，對(duì)于研究飼料中全氟化合物的污染狀況并制定相關(guān)產(chǎn)品的限量指標(biāo)具有積極的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)，配Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；1 2管固相萃取裝置（美國(guó)安捷倫公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公 司，Avanti J－E）；Milli－Q 超 純 水 純 化 系 統(tǒng)（美國(guó) Millipore公司）；分析天平（賽多利斯北京有限公司）。

所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純?cè)噭?，水為超純水；甲醇和乙腈（色譜純，山東禹王）；全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）（CAS 3 3 5－6 7－1，C8HF15O2，純 度 9 8.0%）；全 氟 辛烷磺 酸 鉀 （perfluorooctane sulfonic acid potassium salt，PFOS）（CAS 2 7 9 5－3 9－3，C8F17KO3S，純度9 8.5%），購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer Gm－bH；全氟丁基磺酸鉀（perfluorobutane sulfonic acid potassium salt，PFBS）（CAS 2 9 4 2 0－4 9－3，C4F9KO3S，質(zhì)量濃 度 5 0 mg／L）；全 氟 己 烷 磺酸鉀（perfluorohexane sulfonic acid potassium salt，PFHxS）（CAS 3 8 7 1－9 9－6，C6F13KO3S，質(zhì)量濃度5 0 mg／L）；全氟庚酸（perfluoroheptanoic acid，PFHpA）（CAS 3 7 5－8 5－9，C7HF13O2，質(zhì)量 濃 度 5 0 mg／L）；全 氟 壬 酸 （perfluorononanoic acid， PFNA ） （CAS 3 7 5－9 5－1，C9HF17O2，質(zhì)量濃度5 0 mg／L），購(gòu)自挪威 Chiron公司；全氟辛酸同位素內(nèi)標(biāo)（MPFOA，13C8HF15O2，質(zhì) 量 濃 度 5 0 mg／L），購(gòu) 自 美 國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取50 mg全氟辛酸和全氟辛烷磺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解、定容到100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取該儲(chǔ)備液1.00 mL用乙腈稀釋到100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)中間液；移取該中間液1.00 mL并移取全氟丁基磺酸鉀、全氟己烷磺酸鉀、全氟庚酸和全氟壬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，用乙腈稀釋到10 mL，配成約500μg／L的6種全氟化合物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；移取全氟辛酸同位素內(nèi)標(biāo)1.00 mL，用乙腈稀釋到50 mL，配成1 000μg／L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取空白飼料樣品按1.4節(jié)樣品處理方法處理，在最后的空白樣品溶液中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配成0.5～25μg／L的系列基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0μg／L。

1.3 聚酰胺固相萃取小柱制作

取3 mL的固相萃取用空柱，下端放一篩板，將100～200目的聚酰胺粉加入甲醇成漿狀，濕法裝填，使上篩板用玻璃棒壓實(shí)后聚酰胺填料的厚度約為1.5 cm，使用前用3 mL5%（v／v）氨水／甲醇（5.0 mL氨水用甲醇定容100 mL）、3 mL甲醇和3 mL 0.5%（v／v）甲酸水溶液（2.5 mL甲酸用水定容500 mL）淋洗活化。

1.4 樣品處理方法

稱取5.00 g均勻樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20μL內(nèi)標(biāo)和20.0 mL酸化乙腈（0.5%甲酸乙腈：2.5 mL甲酸用乙腈定容500 mL），蓋緊蓋子，振搖混勻，置于超聲波振蕩器中提取30 min；取出，于4℃、15 000 r／min離心5 min；取5.0 mL上清液于10 mL刻度試管中，用乙腈飽和正己烷渦旋萃取凈化3次，每次2 mL，吸出正己烷層棄去，40℃水浴中氮吹除去殘余正己烷并用乙腈定容至5 mL，再用10.0 mL0.5%甲酸水溶液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中；于4℃、15 000 r／min離心5 min，將上清液通過(guò)聚酰胺小柱，控制流速1～2 mL／min，依次用3 mL0.5%甲酸水溶液、3 mL酸化乙腈和2 mL水淋洗小柱，真空抽干5 min，用3.0 mL5%氨水甲醇以1～2 mL／min流速洗脫并收集，置于40℃水浴中氮吹近干，再用50%（v／v）甲醇水溶液定容到1.0 mL，混勻，用0.2μm 聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

除不加樣品外，同時(shí)做空白試驗(yàn)，應(yīng)確保所使用的試劑、耗材等不含全氟化合物本底。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.3 mL／min；流動(dòng)相及梯度：A為5 mmol／L乙酸銨／甲醇（95／5，v／v）溶液，B為乙腈；0～0.5 min，60%A；0.5～3.5 min，60%A～30%A；3.5～5.0 min，5%A；5.0～7.0 min，60%A。

1.6 質(zhì)譜條件

電離源：大氣壓電噴霧離子源，負(fù)離子模式（ESI（－））；毛細(xì)管電壓3.00 kV；源溫度120℃；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量700 L／h；錐孔反吹氣流量50 L／h；碰撞氣為氦氣，碰撞室壓力0.27 Pa；電子倍增管電壓650 V；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；特征離子見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

分別取約500μg／L的6種全氟化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，由注射泵直接進(jìn)樣，首先作一級(jí)質(zhì)譜全掃描。在ESI（－）模式下，全氟丁基磺酸鉀母離子為m／z 299.0，全氟己烷磺酸鉀母離子為 m／z 399.0，全氟庚酸母離子為m／z 363.0，全氟壬酸母離子為m／z 463.0，全氟辛酸母離子為 m／z 413.0，全氟辛烷磺酸鉀母離子為m／z 499.0，全氟辛酸同位素內(nèi)標(biāo)母離子為m／z 421.0。再對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到6種全氟化合物的子離子，最終確定6種全氟化合物的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)如表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了純水／乙腈體系、0.02%（v／v）甲酸／乙腈體系、0.1%（v／v）甲酸／乙腈體系、0.3%（v／v）甲酸／乙腈體系、0.5% （v／v）甲酸／乙腈體系和 5 mmol／L乙酸銨／乙腈體系作為流動(dòng)相的分離效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純水／乙腈體系出峰完全變形，而5 mmol／L乙酸銨／乙腈體系具有最佳的峰形、分離度和靈敏度。由于純乙酸銨水溶液易長(zhǎng)細(xì)菌發(fā)生沉淀，因此在5 mmol／L乙酸銨流動(dòng)相中加入5%甲醇來(lái)防止細(xì)菌生長(zhǎng)。調(diào)整洗脫梯度為1.5節(jié)條件時(shí)，6種全氟化合物的色譜分離圖見(jiàn)圖1。

表1 全氟化合物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters of the six PFCs and internal standard

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用酸化乙腈為提取劑［6］，該提取劑對(duì)飼料中的全氟化合物具有良好的提取效率；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品提取液的凈化方法和步驟進(jìn)行了深入的優(yōu)化。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的用于全氟化合物的固相萃取柱主要有 Oasis WAX 柱［12］、Oasis HLB 柱［9，10］、Agilent SampliQ OPT 固相萃取小柱［7］、C18固相萃取柱［11］以及C18填料和石墨化炭黑（GCB）分散固相萃取［8］等。由于Oasis WAX柱、Oasis HLB等柱的價(jià)格均較昂貴，因此，本文第一作者曾使用廉價(jià)、自裝填的聚酰胺固相萃取柱萃取了動(dòng)物源食品中的全氟化合物PFOA和PFOS［6］，取得了良好的效果，但對(duì)飼料中全氟化合物的萃取效果尚缺少研究。本研究使用聚酰胺填料對(duì)飼料中的全氟化合物進(jìn)行富集和凈化，并對(duì)聚酰胺固相萃取柱的裝填、過(guò)柱溶液、淋洗液和洗脫液等進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.1 填料厚度選擇

實(shí)驗(yàn)使用3 mL固相萃取空柱管，下端放一篩板，將100～200目的聚酰胺粉加入甲醇制成漿狀，采用濕法裝填，上篩板用玻璃棒壓實(shí)。實(shí)驗(yàn)分別裝填了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 cm6種厚度的聚酰胺小柱，回收率結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明1.5 cm以上的聚酰胺小柱對(duì)6種全氟化合物均有95%以上的回收率，最后確定采用1.5 cm的聚酰胺小柱。

圖1 6種全氟化合物和內(nèi)標(biāo)的總離子流圖和定量離子監(jiān)測(cè)圖Fig.1 TIC and quantitative ion chromatograms of the six PFCs

圖2 填料厚度對(duì)6種全氟化合物的回收率的影響Fig.2 Effect of packing height on the recoveries of the six PFCs

2.3.2 過(guò)柱溶液的制備

取5.0 mL樣品加標(biāo)溶液，按樣品溶液與0.5%甲酸水溶液5∶0（v／v）、5∶5（v／v）和5∶10（v／v）的比例稀釋并離心，過(guò)聚酰胺柱凈化后檢測(cè)；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還比較了采用 Waters Oasis WAX60 mg／3 mL柱按5∶10（v／v）的比例稀釋后凈化的結(jié)果，6種全氟化合物的回收率結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，采用聚酰胺柱按5∶10（v／v）的稀釋比例對(duì)6種全氟化合物的回收率均接近100%并優(yōu)于WAX凈化柱。由于飼料中含有大量脂肪等雜質(zhì)，加水稀釋后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的混濁現(xiàn)象，高速離心也難以去除，嚴(yán)重影響了樣品溶液過(guò)柱的速度。因此，實(shí)驗(yàn)采用乙腈飽和正己烷萃取去除提取液中的油脂和非極性雜質(zhì)，氮吹去除多余正己烷后再稀釋過(guò)柱。

圖3 6種全氟化合物在聚酰胺柱上不同稀釋比例條件下及在WAX柱上的回收率Fig.3 Effect of dilution rate for polyamide SPE column and WAX SPE column on the recoveries of the six PFCs

2.3.3 淋洗液的選擇

為了盡可能地去除雜質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)使用了3mL0.5%甲酸水溶液和3 mL酸化乙腈淋洗小柱，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，全氟化合物能牢固吸附在柱上而大量雜質(zhì)被淋洗去除，6種全氟化合物的回收率均在95%以上。因此，本實(shí)驗(yàn)采用3 mL0.5%甲酸水溶液淋洗后再用3 mL酸化乙腈淋洗小柱。

2.3.4 洗脫液體積的選擇

采用5%（v／v）氨水／甲醇作為洗脫劑，比較了使用1.0、2.0、3.0和4.0 mL洗脫聚酰胺小柱后于40℃水浴中氮吹近干，再溶解定容到1.0 mL后檢測(cè)的效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)洗脫液體積在3.0 mL以上時(shí)6種全氟化合物的回收率均在95%以上。由于酸化乙腈淋洗后用氨水／甲醇洗脫會(huì)生成大量的甲酸銨，在氮吹后會(huì)有大量晶體析出，因此，實(shí)驗(yàn)在酸化乙腈淋洗后再用2 mL水淋洗小柱，真空抽干5 min后再洗脫，從而得到更純凈的樣品溶液。

圖4 洗脫液體積對(duì)6種全氟化合物回收率的影響Fig.4 Effect of elution volume on the recoveries of the six PFCs

2.3.5 定容液的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用甲醇或乙腈溶解樣品，進(jìn)樣10μL時(shí)，色譜峰發(fā)生嚴(yán)重的擴(kuò)展，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量；但隨著溶劑中水含量的提高，色譜峰的展寬得到改善。最終確定以50%（v／v）甲醇水溶液作為溶劑既能保證良好的峰形，又能保證全氟化合物完全溶解并讓樣品溶液易于過(guò)濾。

2.3.6 凈化效果的比較

實(shí)驗(yàn)比較了加標(biāo)豬飼料的未凈化樣品提取液、正己烷萃取凈化提取液和聚酰胺固相萃取柱凈化后的譜圖，結(jié)果表明聚酰胺固相萃取柱具有明顯的凈化效果，大大減少了離子抑制，峰高明顯增大（見(jiàn)圖5），有效地提高了檢測(cè)的靈敏度。

2.4 線性范圍和檢出限

圖5 加標(biāo)豬飼料提取液凈化前后的總離子流圖Fig.5 TIC chromatograms of spiked pig feedbefore and after purification

取標(biāo)準(zhǔn)中間液用空白樣品基質(zhì)液配成0.5～25 μg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以全氟化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），全氟化合物峰面積與全氟辛酸內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），繪制6種全氟化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。同時(shí)，用0.5μg／L樣品加標(biāo)提取液的峰高按3倍噪聲峰高和10倍噪聲峰高確定6種全氟化合物的檢出限和定量限（見(jiàn)表2）。

表2 飼料樣品中6種全氟化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r），LODs and LOQs for the six PFCs in feed

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

取不含全氟化合物的大豬配合飼料、鰻魚(yú)飼料、肉雞全價(jià)料、母豬濃縮飼料、乳豬復(fù)合預(yù)混料和魚(yú)粉等6種樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，每個(gè)添加量做5個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，該方法對(duì)6種全氟化合物的回收率在94.2%～108.9%之間，精密度在1.8%～8.6%之間。

表3 不同飼料中6種全氟化合物的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions in different feed samples（n＝6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采集飼料生產(chǎn)企業(yè)和市場(chǎng)上的配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混料、魚(yú)粉等樣品50個(gè)批次，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果有20個(gè)批次的樣品檢出了全氟化合物，主要為全氟壬酸、全氟辛烷磺酸鉀和全氟辛酸的污染（見(jiàn)表4）。其中有些樣品的全氟辛烷磺酸鉀的含量較高，但其含量均低于10μg／kg，該暴露量不會(huì)對(duì)動(dòng)物健康造成大的影響［19］，但高于7個(gè)氟代碳原子的全氟化合物在生物體具有生物富集效應(yīng)［20］，易造成動(dòng)物產(chǎn)品中全氟化合物含量的提高，如2007年，香港城市大學(xué)的王媛等在中國(guó)8個(gè)地區(qū)采集的雞蛋中全部檢出了PFOS，特別是蛋黃中PFOS含量可高達(dá)107μg／kg［21］。

表4 陽(yáng)性飼料樣品中6種全氟化合物的含量Table 4 Contents of the the six PFCs in positive feed samples μg／kg

3 結(jié)論

本文建立了一種基于聚酰胺固相萃取結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析檢測(cè)飼料中全氟化合物的方法。所建立的分析方法具有前處理成本低、效果好、靈敏度較高、穩(wěn)定性較好和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在調(diào)查飼料中的全氟化合物污染狀況的檢驗(yàn)工作中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

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