同時(shí)提取五味子色素、多糖和木脂素的研究

王 東，徐 菡，趙鎮(zhèn)雷,馮詠梅，常秀蓮，周 紅

(1. 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2. 青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司，山東 萊西 266612)

五味子(SchisandrachinensisBaill.)又名山花椒，因其果實(shí)具有甘、苦、酸、辛、咸而得名[1].五味子是雙子葉植物門、木蘭亞綱、八角目、五味子科植物[2]，根據(jù)五味子醇甲和五味子酯甲的含量，五味子又分北五味子屬(Schisandra)和南五味子屬(Kadsura)2個(gè)屬，北五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)的特征成分為五味子醇甲，其含量不少于0.4%，南五味子又名華中五味子特征成分為五味子酯甲，其含量不少于3.0%[3].

五味子含有木脂素、有機(jī)酸、維生素、色素、揮發(fā)油及多糖等多種成分[4-6]，自從1970年發(fā)現(xiàn)它具保肝降酶作用以來，研究還發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗?jié)?、?zhèn)靜、抗艾滋病毒、拮抗血小板活化因子和抑制醛糖還原酶等多種活性[7].五味子作為一種新型的“藥食同源”功能性保健食品，應(yīng)用范圍愈來愈廣，其果實(shí)已成為新興食品工業(yè)的一種重要原料.但目前的研究多數(shù)僅限于對(duì)其中一種成分的研究，缺少對(duì)五味子多種活性成分的綜合提取研究，造成五味子資源的浪費(fèi).因此如何提高五味子資源的利用率，綜合利用五味子資源是目前亟待解決的問題之一.

1 料料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；752S紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DL-5型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

五味子果實(shí)，吉林鵬遠(yuǎn)生物科技有限公司提供；葡萄皮色素，青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司提供；五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品，上海順勃生物制藥公司；甲醇，色譜純；其他試劑為分析純；SP207樹脂，日本三菱化學(xué)樹脂，北京慧德易科技有限責(zé)任公司供應(yīng).

1.3 分析方法

1.3.1 木脂素含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的含量.木脂素含量以上述六種木脂素含量之和來計(jì)算[8].

1.3.2 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[9].

1.3.3 花青素含量的測(cè)定 采用示差法[10]，按矢車菊-3-葡萄糖苷來計(jì)算.

1.3.4 色價(jià)測(cè)定 通過測(cè)定吸光度值來計(jì)算[11].

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)處理 將五味子果實(shí)于40 ℃下烘干，粉碎，粒度為40～60目.

1.4.2 提取流程 2種同時(shí)提取五味子木脂素、色素和多糖的實(shí)驗(yàn)流程，見圖1、圖2.

圖1 同時(shí)提取色素、多糖和木脂素流程Ⅰ

圖2 同時(shí)提取色素、多糖和木脂素流程Ⅱ

1.4.3 五味子色素和多糖的提取 稱取上述五味子粉末50 g，加入10倍體積的蒸餾水，于80 ℃水浴中攪拌提取2 h.離心后的殘?jiān)貜?fù)提取5次，測(cè)定每次提取的多糖和色素的含量，計(jì)算多糖的提取率.

1.4.4 大孔樹脂吸附分離色素和多糖 經(jīng)過預(yù)處理的SP207樹脂采用排水法裝柱.由1.4.2項(xiàng)圖2得到的色素粗提液，以1 BV/h的流速上柱，待樹脂吸附飽和，將流出液濃縮、醇沉，用于提取多糖.

當(dāng)樹脂吸附飽和后，先用蒸餾水洗柱去除雜質(zhì)，直到流出液澄清.然后用含有0.3%檸檬酸的70%乙醇水溶液(1 BV/h)洗脫，收集洗脫液.收集洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，然后60 ℃干燥，稱重，計(jì)算色素的得率.

1.4.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化回流提取五味子木脂素 取提取完色素和多糖的五味子干渣20 g，9份，按1∶10的固體和乙醇水溶液料液比加入乙醇水溶液，乙酸乙酯和乳化劑EM的加入量均按占乙醇水溶液的體積百分比計(jì)算.設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示.表1中，A指乙醇水溶液的濃度，B、C分別指加入的乙酸乙酯、EM與乙醇水溶液的體積百分比.超聲30 min，回流提取2次，每次2 h.將上清液混合、濃縮至浸膏，以原溶液1/2體積蒸餾水溶解，分別用HPLC法和分光光度法測(cè)溶液木脂素含量和透光率.

表1 試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 同時(shí)提取色素、多糖和木脂素實(shí)驗(yàn)流程優(yōu)化

采用圖1和圖2所示的實(shí)驗(yàn)流程同時(shí)提取木脂素、色素和多糖，2種流程的結(jié)果比較如表2所示.

表2 2種流程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，流程Ⅰ的木脂素雖然提取率高于流程Ⅱ，但得率低；流程Ⅱ的色素得率也高于流程Ⅰ.實(shí)驗(yàn)流程Ⅰ提取液中含有大量的色素等雜質(zhì)，在樹脂純化之前，先去除提取液中的乙醇，加入少量的水進(jìn)行混合，然后用乙酸乙酯萃取，得到的下相是含有大量色素的水相，上相乙酸乙酯相是主要含有木脂素和少量色素，基本上將色素和木脂素進(jìn)行了有效的分離，但與實(shí)驗(yàn)流程Ⅱ相比，流程Ⅰ比較復(fù)雜，增加了乙酸乙酯的萃取步驟，而且乙酸乙酯相中仍然含有少量的色素；流程Ⅱ先采用熱水提取法，將色素和多糖分離出去，剩余的殘?jiān)兄饕心局兀@樣提取的木脂素純度得到提高，木脂素是3種目標(biāo)產(chǎn)品中最有價(jià)值的，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用方案Ⅱ.

2.2 五味子色素和多糖提取

綜合考慮到五味子色素的穩(wěn)定性和多糖的提取率，前期實(shí)驗(yàn)得到適宜的提取溫度為80 ℃，研究提取次數(shù)對(duì)五味子多糖和色素提取率的影響.以提取次數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖提取率和色素在520 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，得出多糖提取率和色素量隨提取次數(shù)的變化曲線，如圖3所示.

圖3 提取次數(shù)對(duì)五味子多糖和色素提取率的影響

從圖3可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，五味子色素和多糖的提取率越來越低.當(dāng)提取次數(shù)超過3次時(shí)，多糖的提取率和色素的含量變化不顯著.前3次多糖的提取率為89.47%，色素的提取率為85.45%，考慮到實(shí)際應(yīng)用的生產(chǎn)成本和工作量，水法提取五味子色素和多糖的最佳提取次數(shù)為3次.

2.3 SP207樹脂分離多糖和色素

將色素和多糖的提取液上SP207樹脂柱，多糖不被吸附，流出柱子，色素被吸附并得到純化.當(dāng)上料液體積達(dá)到120個(gè)柱體積時(shí)，色素樹脂吸附飽和.真空濃縮流出液，用4倍體積的95%乙醇醇沉得到粗多糖沉淀，無水乙醇洗滌3次后干燥，得粗多糖8.2 g，粗多糖得率8.2%,和多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的最佳提取條件(100 ℃提取多糖的得率11.3%)接近[12].

五味子含有大量有機(jī)酸，pH值約為3.0，提取5次后pH值仍為3.0～3.2，說明五味子在此pH下緩沖能力很好，可采用水法直接提取色素和多糖，不需要調(diào)節(jié)pH.此法成本低，無毒、無污染，產(chǎn)品后處理簡單，提取率高，可用于工業(yè)生產(chǎn).

當(dāng)洗脫液為2個(gè)柱體積時(shí)，大部分色素被洗脫下來．洗脫液真空濃縮，60 ℃烘干后得到色素3 g，得率3%，色價(jià)2．87，花青素為2．75mg/g，干燥物粘稠，色價(jià)和花青素含量較低，可能色素吸附后，用水清洗不充分，使糖類的殘留量高．考慮到色素收率較低，工業(yè)化生產(chǎn)不建議從五味子中提取色素.

2.4 從渣子中提取五味子木脂素

文獻(xiàn)[13]中優(yōu)化的乙醇和乳化劑EM聯(lián)合提取木脂素的方法得到的粗提液比較混濁，長時(shí)間放置，溶液有沉淀產(chǎn)生，采用乙酸乙酯進(jìn)行二次萃取純化雖然可以改善溶液的澄清度，但過程比較麻煩，而且木脂素?fù)p失較大.因此嘗試在提取過程中加入乙酸乙酯進(jìn)行提取，以木脂素含量和透光率為指標(biāo)考察溶劑組成對(duì)木脂素提取效果的影響，結(jié)果見表3.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

由表3透光率極差值大小可知，各因素作用主次為A>B>C，最佳溶劑配比為A3B1C2，即乙醇水溶液濃度為80%,乙酸乙酯和EM的加入量分別為乙醇水溶液體積的10%和2%.由木脂素含量極差值大小可知，各因素作用主次為A>B>C，最佳溶劑配比為A1B2C3，即:乙醇水溶液濃度為60%,乙酸乙酯和EM的加入量分別為乙醇水溶液體積的10%和3%.可見,以提取液透光率和木脂素含量為指標(biāo)得出的最佳條件不一致，所以在上述2個(gè)最佳提取條件下，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，提取五味子木脂素，測(cè)定樣液的木脂素含量和透光率，結(jié)果見表4.

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，透光率高的試驗(yàn)組五味子木脂素含量也高，說明溶液的澄清度對(duì)五味子木脂素含量的測(cè)定有影響.通過表4的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)五味子木脂素含量無顯著影響，因此可忽略其影響效果，只考察溶液透光率的影響.通過觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)提取液放置一段時(shí)間后，實(shí)驗(yàn)組1～3出現(xiàn)沉淀，說明其乳化效果不佳.而用液相色譜法測(cè)定木脂素含量時(shí)，樣液必須用0.45 μm濾膜過濾，沉淀的木脂素不能透過濾膜，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響.

綜合以上結(jié)果，采用第4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取五味子木脂素，即乙醇水溶液濃度為80%、乙酸乙酯和EM的加入量分別為乙醇水溶液體積的10%和2%時(shí)，粗提液比較澄清，穩(wěn)定性較好，無沉淀，木脂素含量高，有利于進(jìn)一步純化五味子木脂素.

3 結(jié) 論

(1)建立了同時(shí)提取五味子多糖和木脂素的最佳工藝流程：

五味子—粉碎—水提多糖和色素—樹脂吸附脫色—多糖不被吸附—濃縮酒精沉淀—多糖；

渣子—溶劑提取木脂素—樹脂純化—木脂素.

(2)從五味子中提取天然色素，工業(yè)化生產(chǎn)意義不大.

(3)多種溶劑混合的回流提取法提取五味子木脂素的最佳溶劑組成為:乙醇水溶液濃度為80%,乙酸乙酯和乳化劑EM的加入量分別為乙醇水溶液體積的10%和2%.

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