離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定乳粉的汞形態(tài)

林 立，王琳琳，孫海波，孫繼紅

(1.北京工業(yè)大學，北京 100022；2.國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心,北京 100094)

汞化合物的生物化學行為和毒性與它們的化學形態(tài)密切相關(guān)，僅僅從總量來評價其安全性是不科學的。有機汞的毒性大于無機汞，其中甲基汞的毒性最強。由于甲基汞具有親脂性、生物積累效應和生物放大效應，其毒性是無機汞的幾百倍[1]。有機汞化合物在農(nóng)業(yè)中常用作殺蟲劑和殺菌劑，很容易進入生物食物鏈[2]，造成食品安全事件頻頻發(fā)生，例如2012年奶粉的汞超標事件。對于汞形態(tài)分析，應屬水產(chǎn)品的報道較多，在這些基體中汞常以甲基汞的形態(tài)存在；而對乳粉樣品的汞形態(tài)研究還未見報道。對于乳粉樣品，由于基質(zhì)的復雜性，乳粉中蛋白、脂肪、乳糖等有機物中所含的巰基與汞化合物的結(jié)合非常牢固，形成穩(wěn)定的絡合物，要將汞的各種形態(tài)從結(jié)合態(tài)中完全解離出來是汞形態(tài)分析工作的重點，同時在前處理過程中須保證各形態(tài)提取完全且各形態(tài)之間不會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，因此，樣品前處理是汞形態(tài)分析的難點。

乳粉中汞含量極低，也對汞形態(tài)分析的檢出限提出了更高的要求。目前汞形態(tài)分析的方法很多，對汞形態(tài)的分離常采用色譜分離技術(shù)，如氣相色譜[3-4]、高效液相色譜[5-11]、離子色譜[12]、毛細管電泳分離[13-14]等。常用的檢測手段有電化學檢測器(ECD)、原子吸收光譜儀(AAS)[3]、原子熒光光譜儀(AFS)[5,8-10,15]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)[4,6-7,11-12,14]等。各種分離技術(shù)均有優(yōu)缺點。如采用氣相色譜進行分離，在前處理過程中需要衍生化，操作較為繁瑣；采用毛細管電泳分離，設(shè)備普及率不及其他的分離手段。在檢測手段方面，ECD、AAS、AFS、ICP-AES的檢測靈敏度均不及ICP-MS；且ICP-MS具有很高的靈敏度和很好的選擇性，對于汞的分析，選擇豐度比最高的202作為采集的質(zhì)量數(shù)，在乳粉基質(zhì)中無質(zhì)譜干擾，與離子色譜聯(lián)機無需特別的接口，硬件條件很容易實現(xiàn)。

本文建立了一種離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(IC-ICP-MS)測定乳品中汞形態(tài)的分析技術(shù)。實驗室重點優(yōu)化了樣品的前處理方法，采用多種復合酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)對奶粉基質(zhì)中的蛋白、脂肪、淀粉進行解離，以L-半胱氨酸、鹽酸和甲醇的混合溶液作為提取劑進行超聲提取，樣品過RP固相萃取小柱去除雜質(zhì)后導入Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)進行分離，流動相采用10 mmol/L乙酸銨-0.12% L-半胱氨酸-5%甲醇混合溶液進行淋洗，最后通過ICP-MS對三種汞形態(tài)(二價汞、甲基汞、乙基汞)進行定量。該方法可為乳粉中汞的富集形態(tài)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器及工作條件

ICS1500型離子色譜儀(美國Thermo公司)。離子色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)；淋洗液：10 mmol/L乙酸銨-0.12%L-半胱氨酸-5%甲醇混合溶液；流速1 mL/min；進樣量20 μL。

Agilent 8800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。同心霧化器；石英霧化室：半導體控溫(2±0.1)℃；屏蔽矩。質(zhì)譜儀參考條件見表1。

色譜柱與ICP-MS相聯(lián)的管線距離不超過0.5 m。

DMA80測汞儀(法國麥爾斯通公司)。

表1 ICP-MS儀器工作條件

超純水機(德國Merk公司)，超聲波清洗器KQ-500E(昆山市超聲儀器有限公司)，水浴鍋(北京長安永創(chuàng)科學儀器有限公司)，冷凍離心機(湖南湘儀設(shè)備有限公司)。

1.2 標準溶液與主要試劑

甲基汞(76.6 μg/g)、乙基汞(75.3 μg/g)、二價汞(1000 μg/mL)標準溶液：購自中國計量科學研究院。調(diào)諧溶液：10 ng/mL鋰、鈷、釔、鈰、鉈混合標準溶液(2%硝酸介質(zhì)，貨號Part#5184-3566，購自美國Agilent公司)。

內(nèi)標溶液：1.0 μg/mL鉍標準溶液(2%硝酸介質(zhì))：購自中國計量科學研究院。

L-半胱胺酸(純度>98%，美國Sigma公司)。

蛋白酶(活性≥400 units/mg，美國Sigma公司)，脂肪酶(活性≥700 units/mg，美國Sigma公司)；α-淀粉酶(活性300～5000 units/mg，天津市福晨化學試劑廠)。

RP固相萃取小柱(1 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)。

甲醇(色譜純，百靈威公司)，硫代硫酸鈉(分析純，北京化學試劑廠)，鹽酸(優(yōu)級純，北京化學試劑廠)，超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，用于配制所有標準溶液與樣品溶液。

1.3 實驗方法

稱取約0.5 g樣品于30 mL錐形瓶中，加入約20 mL水搖勻，蓋上瓶塞，加入蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶各0.06 g(或配成溶液添加)，置于37℃水浴鍋中酶解14 h后，加入30 g/L的L-半胱胺酸1.0 mL、5 mol/L鹽酸0.5 mL和甲醇1.25 mL振蕩提取10 min。用水定容至25 mL比色管中，5000 r/min高速離心后，取上清液過RP小柱，過0.45 μm濾膜后導入C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)進行分離，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進行定量，同時準備試劑空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法

檢測乳制品中的汞形態(tài)，樣品前處理的難度大于文獻中常報道的海產(chǎn)品和環(huán)境樣品的前處理[3-4,8-9,11-12,16 ]。樣品中有機汞非常容易和樣品中蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合，穩(wěn)定地絡合在蛋白上，會隨著蛋白沉淀時沉淀下來或者是與蛋白質(zhì)共同吸附在分離色譜柱上，無法洗脫，無法被檢測器檢測。乳粉基體主要由約20%的蛋白質(zhì)、約30%的脂肪和約50%的乳糖組成[17-18]。蛋白、脂肪、淀粉等物質(zhì)如果不在前處理過程中去除，會對色譜柱造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。保證汞的各種形態(tài)在蛋白沉淀的過程中不隨著共沉淀而損失，同時保持形態(tài)的穩(wěn)定是本研究工作的重點。

2.1.1 樣品中雜質(zhì)的去除

乳粉樣品基質(zhì)復雜，要采用色譜柱進行分離，首先需去除基質(zhì)中的蛋白。乳粉樣品的除蛋白方式通常有以下幾種：乙腈沉淀蛋白、乙酸沉淀蛋白、等電點沉淀蛋白以及酶解沉淀的方式。乙腈沉淀蛋白體系的樣品中，由于含有大量的乙腈(一般含量在60%左右)，采用ICP-MS檢測時，在溶劑流出的一瞬間，有機相含量太大，等離子體條件發(fā)生了較大變化，造成ICP-MS氬火焰不穩(wěn)定，甚至熄滅，無法正常檢測。乙酸沉淀蛋白體系雖然對于ICP-MS檢測而言不存在較大的問題，但是由于現(xiàn)在的乳粉成分較為復雜，有些樣品含有類似于增稠劑的食品添加劑等物質(zhì)，采用乙酸沉降的方式很難沉淀下來，并不能適合于所有的奶粉基質(zhì)。等電點沉淀蛋白體系適用于所有基質(zhì)的乳粉，但是操作過程較為繁瑣，需要對每個樣品調(diào)其pH值，不適合大批量樣品的檢測。

本實驗室選擇酶解的方式去除雜質(zhì)，對酶的用量、酶解時間進行了條件摸索。針對乳粉基質(zhì)，實驗室采用蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶組成的復合酶對乳粉進行酶解。復合酶的用量對酶解效果起著很重要的作用。一般而言，底物含量越高酶解的效果越好，但是酶本身也是一種蛋白質(zhì)，其加入量過多也會吸附各種形態(tài)的汞，降低回收率。

在酶的用量實驗中，稱取約0.5 g樣品于30 mL具塞三角瓶中。加入蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的含量分別由0.02 g逐級增加到0.1 g，對酶解效果進行評價。當各種酶的含量分別為0.06 g時，酶解效果較好。同時將酶解后的溶液過0.45 μm濾膜和RP小柱去除其中的蛋白，得到的樣液采用測汞儀檢測總汞含量得出了相同的結(jié)論。在此條件下，總汞的含量最大，酶解效果最好，汞從蛋白基質(zhì)中的解離效果最好。

在酶解時間實驗中，當酶解時間達到14 h以上時，酶解基本完成。一般在pH>4.5的條件下進行酶解較好，實驗室測試了0.5 g乳粉溶解在約20 mL的超純水中時pH=6.5，滿足酶解的條件，無需調(diào)節(jié) pH值。酶解溫度則一般選擇細菌的培養(yǎng)溫度37℃。

2.1.2 提取溶液的選擇

對于汞形態(tài)分析，不同的樣品基體需采用相應的提取方法，常用的提取方法有酸提法、堿提法以及超臨界流體萃取等[16]。實驗室對于酸提取和堿提取兩種提取方法進行了考察，樣品溶液經(jīng)處理用IC-ICP-MS進行形態(tài)分析。選擇不含汞的乳粉樣品在基質(zhì)上加標試驗，考察汞的各種形態(tài)的提取率(回收率)。

從表2的實驗結(jié)果可以看出，對于不同的汞形態(tài)，不同提取體系的提取率各不相同。采用體系②進行提取，二價汞和甲基汞的回收率很高，而乙基汞的回收率在80%左右。當提取液中有硫代硫酸鈉時，可以提高乙基汞的回收率，即采用體系①進行提取，這時乙基汞的回收率明顯增加，接近100%，但是二價汞的回收率極低，無法滿足檢驗的要求。體系③是堿性體系，汞各形態(tài)的回收率均較低，顯然不適合應用。綜合考慮三種體系中汞形態(tài)的回收率結(jié)果，本文確定采用體系②(即0.12% L-半胱氨酸溶液+0.1 mol/L鹽酸+5%甲醇)進行提取。

2.1.3 提取方式的選擇

一般溶劑提取采用超聲、振蕩、恒溫水浴等方式。由于振蕩法和恒溫水浴法的提取時間較長，實驗室對超聲提取進行了條件摸索。將酶解后的溶液加入L-半胱氨酸、鹽酸和甲醇混合溶液進行萃取，萃取時間分別設(shè)定為0、5、10、20、30、40、50、60 min。從圖1可以看出10 min后提取量沒有明顯的變化，最終確定超聲時間選擇為10 min。同時在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，超聲時間越長，乙基汞逐漸轉(zhuǎn)化為二價汞，所以超聲時間也不宜太長。

圖1 超聲時間對提取率的影響

2.2 離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)機檢測條件

2.2.1 色譜柱和淋洗液的選擇

進行汞形態(tài)分析，常用反相高效液相色譜柱作為分離手段。在反相鍵合色譜中，固定相的極性小于流動相的極性，適合于分離非極性、極性和離子型化合物[16]。本實驗選擇C18柱作為汞形態(tài)的分離柱，選擇適當?shù)碾x子對試劑與汞化合物反應，生成非極性化合物在反相柱上進行分離。

實驗室還考察了L-半胱氨酸、四丁基溴化銨、溴化鉀體系作為離子對試劑對汞形態(tài)進行洗脫。L-半胱氨酸的洗脫能力明顯強于四丁基溴化銨和溴化鉀，同時L-半胱氨酸也作為一種絡合劑，它的含量還會影響汞形態(tài)的峰形。當L-半胱氨酸的含量較低時，汞的各種形態(tài)的保留時間較長，峰形拖尾；當汞含量增加到一定程度時，二價汞與甲基汞的分離效果變差，峰形卻越來越尖銳；然而汞含量越高，帶入的鹽類不僅僅是容易在ICP-MS的截取錐錐口沉積，同時對色譜柱的損傷也較為嚴重。當L-半胱氨酸的濃度在0.12%時，能在5 min內(nèi)完成分離。

甲醇在檢測過程中有著雙重的作用。①淋洗液中甲醇的加入會影響到極性，甲醇含量越大，汞的各種形態(tài)的保留時間越短；當甲醇濃度增加到10%時，二價汞與甲基汞很難實現(xiàn)完全的基線分離，因此要求甲醇的濃度在10%以下。②汞元素用ICP-MS測試的靈敏度較低，因為汞的第一電離能為1007.1 kJ/mol，電離效率較低。因此，甲醇作為一種有機試劑，還對ICP-MS檢測具有增敏效應，增敏效應產(chǎn)生的原因可能是電離的碳離子與部分未電離的目標離子之間發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移效率，提高了汞的電離效率，增強了靈敏度[19-20]。但是當甲醇的含量增加到過量的程度，會使等離子體炬的參數(shù)發(fā)生較大變化，反而增加了電離的負擔，靈敏度又會下降。實驗數(shù)據(jù)也證明了這一點。圖2為不同的甲醇濃度條件下，10 μg/L汞溶液的靈敏度的變化。當甲醇含量約5%時，汞的靈敏度最高，這與色譜分離要求的甲醇含量在10%以下的條件相吻合，最終選擇甲醇的濃度為5%。

對分離條件進行優(yōu)化后，在5 min內(nèi)能實現(xiàn)三種汞形態(tài)的基線分離(圖3)。

圖2 甲醇對汞檢測靈敏度的影響

2.2.2 質(zhì)譜分析條件的選擇

汞在自然界共有6個同位素，其中豐度比較高的同位素有199Hg、200Hg、201Hg、202Hg，豐度比分別為16.87%、23.10%、13.18%、29.86%，這些質(zhì)量數(shù)分別容易受到183W16O、184W16O、185Re16O、186W16O等多原子離子的干擾，然而可能干擾的這些物質(zhì)幾乎不存在于食品基體中，所以實驗室選擇了豐度比最高的202作為采集的質(zhì)量數(shù)，樣品基質(zhì)中無質(zhì)譜干擾。

2.3 方法檢出限和線性范圍

將濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L的二價汞、甲基汞和乙基汞系列標準溶液進行了線性范圍的測定，三條曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。調(diào)諧儀器到最佳狀態(tài)，進樣量10 μL。選擇汞本底值較低的試劑進行實驗，保證較低的基線背景。在最終確定的儀器條件下，奶粉中的二價汞、甲基汞和乙基汞的儀器檢出限分別為0.01 μg/L、0.012 μg/L、0.018 μg/L(見表3)。對于乳粉樣品如果稀釋倍數(shù)是50倍時，固體樣品的檢出限分別為0.5 μg/kg、0.6 μg/kg、0.9 μg/kg。相關(guān)文獻[7]采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)測定二價汞、甲基汞、乙基汞，本文采用的IC-ICP-MS儀器檢出限與HPLC-ICP-MS方法相比較降低了一倍，達到了較好的檢測水平，完全滿足乳粉中痕量汞形態(tài)檢測的要求。

表3 線性方程、線性范圍和儀器檢出限

2.4 加標回收率和精密度

為了考證汞的各形態(tài)的回收率情況，選擇樣品中汞含量低的樣品進行加標回收實驗。分別在樣品中加入2、10、20 μg/L 三個梯度的單標溶液，各溶液平行測定6次(n=6)。由表4可以看出，無論是二價汞、甲基汞還是乙基汞，加標回收率均在79.9%～111.2%之間，精密度(RSD)在1.7%～3.2%之間，完全滿足實驗的要求。

表4 方法加標回收率和精密度

3 實際樣品分析

采集5種實際乳粉樣品，用測汞儀測定乳粉的總汞含量，同時采用本工作建立的IC-ICP-MS方法分析二價汞、甲基汞、乙基汞三種汞形態(tài)，以三種汞形態(tài)的加和值與總汞檢測結(jié)果相比較得到提取率，分析結(jié)果列于表5。從實驗結(jié)果可以看出，對于汞總量很低的乳粉樣品，汞各形態(tài)的提取率也能達到70%以上，可以滿足實驗的要求。

采用本工作建立的IC-ICP-MS方法對魚肉國家標準物質(zhì)(GBW 10029)進行測定，總汞與甲基汞的含量與相應的標準值吻合，證明該方法準確可靠(表5)。

圖4為某汞含量高的乳粉的色譜分離圖，可以看出奶粉中汞的富集形態(tài)主要是二價汞和甲基汞。

表5 乳粉中汞的形態(tài)分析

圖4 乳粉樣品中汞形態(tài)的色譜分離圖

4 結(jié)語

乳粉的汞形態(tài)分析存在一些難點，如由于基質(zhì)的復雜性造成提取率低、乳粉中汞含量極低對方法檢出限提出了更高的要求，本文建立的離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜方法解決了這些難點問題。該方法前處理過程中采用酶解的方式解離復雜基體中的汞形態(tài)，提高了提取率，儀器檢測條件方面采用甲醇作為增敏劑，提高了檢測靈敏度，方法檢出限低。

本方法可以應用于乳粉樣品的實際檢測工作。而針對乙基汞的加標回收率(79.9%～87.3%)較低的問題，有待于進一步優(yōu)化實驗條件，提高乙基汞的檢測能力。

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