白芨種子的高效萌發(fā)及其無(wú)性繁殖體系的構(gòu)建＊

王楷， 李玥， 張?jiān)品澹?，3， 田寶強(qiáng)， 楊秀梅， 普家寧， 嚴(yán)勝柒

（1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650500；2.教育部生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用工程中心，云南 昆明6505002；3.云南師范大學(xué)、臺(tái)灣新竹清華大學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650500；4.昭通市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣研究所，云南 昭通657000）

白芨 （Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.）為蘭科白芨屬的多年生草本植物，別名紫蘭、紫蕙、百笠等.全世界白芨屬植物有6種，我國(guó)有4種，分別為白芨、小白芨 （B.formosana（Hayata）Schltr.）、黃花白芨 （B.ochracea Schltr.）及華白芨（B.sinensis（Rolfe）Schltr.）.白芨假鱗莖為我國(guó)傳統(tǒng)中藥［1］，含有近50種化合物［2］，具有收斂、補(bǔ)血、止血、消腫等多種功能［3－4］.現(xiàn)代藥理研究表明白芨可使凝血酶生成時(shí)間縮短，能抑制纖維蛋白酶的活性，使細(xì)胞快速凝聚形成血栓而止血［5］，具有保護(hù)胃黏膜［6］、抗真菌［7］及抗癌［8］等作用.此外，白芨膠還可用作乳化劑、懸浮劑，代替西黃蓍膠和阿拉伯膠，在醫(yī)藥、化工、食品等方面的應(yīng)用前景十分廣闊［9］.

由于野生白芨遭到過(guò)度采挖，加上其野生生境的破壞，導(dǎo)致我國(guó)野生白芨資源急劇減少，瀕臨滅絕，已被國(guó)家列為珍稀瀕危的保護(hù)植物［10］.白芨種子非常細(xì)小且無(wú)胚乳，自然狀況下萌發(fā)率極低，并且生長(zhǎng)緩慢.傳統(tǒng)栽培主要依賴分株繁殖［11］，而分株繁殖周期長(zhǎng)、繁殖效率低、耗種量大，很難滿足規(guī)模栽培的需要.自Kundson首次進(jìn)行蘭科植物種子的無(wú)菌萌發(fā)以來(lái)，無(wú)菌萌發(fā)已成為蘭科植物種質(zhì)保存及規(guī)模繁殖的重要手段.蘭科種子的萌發(fā)率依賴于培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)基中的添加物及外源激素.添加椰汁乳、香蕉汁、菠蘿汁、馬鈴薯汁等能促進(jìn)種子的萌發(fā)，其中椰汁乳被認(rèn)為是最為有效的添加物［12］.目前，國(guó)內(nèi)對(duì)白芨無(wú)菌播種已有諸多的報(bào)道［13－14］，并對(duì)白芨種子的無(wú)菌萌發(fā)過(guò)程［15］、白芨種子染菌萌發(fā)過(guò)程的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化［16］進(jìn)行了研究，這些研究對(duì)白芨種質(zhì)資源保護(hù)及其繁殖具有較大的促進(jìn)作用，但相關(guān)報(bào)道中白芨種子的萌發(fā)率都較低，而且萌發(fā)周期較長(zhǎng).本研究擬以液體培養(yǎng)，以期建立白芨種子的高效無(wú)菌萌發(fā)體系及其無(wú)性繁殖體系，為實(shí)現(xiàn)白芨的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為成熟未開(kāi)裂的野生白芨蒴果，蒴果于2013年7月采自云南省昭通市威信縣瓦石村后山（北緯27°49′7.85"，東經(jīng)104°46′57.81"）.該地區(qū)干濕季分明，日溫差小，年溫差大，年平均氣溫為12.4℃.冬季雨量少氣溫低，平均溫度為4℃，最低溫度為－1.0℃；夏季雨量大氣溫高，平均溫度為21.6℃，最高溫度31.4℃.

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌播種

選取成熟未裂蒴果用流水洗凈，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒，消毒過(guò)程為：75%的酒精表面消毒30s，再用0.15%的升汞（HgCl2）消毒10min，無(wú)菌水沖洗5～6次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分.在無(wú)菌條件下，用手術(shù)刀縱向剖開(kāi)蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子均勻播種于培養(yǎng)基.放置種子后先將培養(yǎng)基置于暗條件下培養(yǎng)，種子萌發(fā)后再移至光照條件下.基本培養(yǎng)基采用MS、1／2MS的大量元素及全量的微量元素［17］、KC［18］和 VW［19］，每類基本培養(yǎng)基又設(shè)置8組，如表1.所有培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖，固體培養(yǎng)基添加0.6%的瓊脂粉.滅菌前將培養(yǎng)基的pH值調(diào)整到5.8，每個(gè)處理重復(fù)8次.種子培養(yǎng)30d后，觀察基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基類型、添加物及6－BA濃度對(duì)種子萌發(fā)率的影響.在低倍倒置顯微鏡下以每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)200粒種子的萌發(fā)計(jì)算，統(tǒng)計(jì)重復(fù)5次.

表1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基Table 1 Mediums used for seed germination in Bletilla striata

為檢驗(yàn)椰子汁濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響，作了補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)：以1／2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置5個(gè)組，每組8瓶，分別添加0、10%、20%、30%、40%的椰汁乳.所有培養(yǎng)基6－BA 濃度為1.0mg·L－1，均添加3%的蔗糖，滅菌前將pH值調(diào)整至5.8.培養(yǎng)30d后觀察各組的種子萌發(fā)率，并測(cè)量各組的原球莖鮮重及原球莖長(zhǎng)度.原球莖鮮重（M）測(cè)量方法：種子放置培養(yǎng)基后，立即稱量并記錄為M1，30d后用同樣的方法稱量并記錄為M2，則M＝M2－M1.每個(gè)處理記錄5瓶，求平均數(shù).

1.2.2 測(cè)定發(fā)育后種子活力

種子播種培養(yǎng)30d后，用0.1%的 TTC（2，3，5－Triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯基四氮唑）溶液測(cè)定種子活力，染色時(shí)間為0.5h，5次重復(fù).著色后，在顯微鏡下觀察種子染色情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野的種子總數(shù)、有活力種子數(shù)和敗育種子數(shù).凡是胚染成有光澤的鮮紅色，為有生活力的種子；凡是完全不染色或染成無(wú)光澤的淡紅色或灰白色，為敗育或無(wú)活力種子數(shù).

1.2.3 無(wú)性繁殖體系構(gòu)建

種子萌發(fā)形成原球莖后，將原球莖轉(zhuǎn)接到無(wú)性繁殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以全量MS為培養(yǎng)基，添加10%椰汁乳、3%蔗糖及不同激素6－BA（6－Benzylaminopurine）和 NAA（1－Naphthaleneacetic acid）的組合配比（表2），pH 調(diào)至5.8.每個(gè)處理接種10瓶.培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光照強(qiáng)度2 200～2 600lx，光照時(shí)間10h／d.培養(yǎng)30d后，觀察原球莖的生長(zhǎng)狀況和調(diào)查原球莖繼代增殖數(shù)情況，增殖倍數(shù)以繼代培養(yǎng)35d的原球莖突起數(shù)與繼代當(dāng)天的原球莖數(shù)比值.

表2 擴(kuò)繁培養(yǎng)基Table 2 Medium used for propagation in Bletilla striata

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白芨種子無(wú)菌萌發(fā)

采集種子（圖1B）經(jīng)消毒處理播種于培養(yǎng)基，黑暗條件下培養(yǎng)18d后，在液體培養(yǎng)基中可觀察到少數(shù)種胚膨大（圖1G），繼而突破種皮開(kāi)始萌發(fā)（圖1H－I），轉(zhuǎn)入光照下培養(yǎng)種子開(kāi)始變綠（圖1 F，J）.而在固體培養(yǎng)基中，22d后才觀察到種子萌發(fā)（圖1C－E）.蘭花種子在自然條件下發(fā)芽率很低，影響其萌發(fā)的因素有種皮的機(jī)械阻力和透水性差、種胚發(fā)育不全、貯存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)少以及可能存在抑制物質(zhì)等.白芨種子也不例外，種子呈粉末狀，無(wú)胚乳，解剖鏡下觀察，種子呈紡錘形，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由1層透明的種皮和1個(gè)種胚組成，自然條件下萌發(fā)率極低.在后續(xù)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，在固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基（6－BA濃度1.0mg·L－1、椰汁乳濃度10%）中添加1%的活性炭并未提高其萌發(fā)率.由此推斷白芨自然條件下萌發(fā)率低與其胚發(fā)育程度低及貯存物質(zhì)不足有關(guān).對(duì)培養(yǎng)35d的白芨進(jìn)行TTC染色，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基中的種子活力高（實(shí)際是種子培養(yǎng)后的胚存活率）（圖1K，圖4），而固體培養(yǎng)基中的種子活力低（圖1L，圖4）.

圖1 白芨種子萌發(fā)過(guò)程Fig.1 The seeds germination course of Bletilla striata

2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響

在激素同為6－BA 0.5mg·L－1的4種基本培養(yǎng)基（1／2MS、MS、KC、VW）中，發(fā)現(xiàn)1／2MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高.1／2MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率為（41.93±3.98）%，而在 MS、KC及 VW 培養(yǎng)基中的萌發(fā)率分別為（35.75±2.54）%、（29.47±2.39）%及（32.54±3.12）%（圖2）.在p＜0.05時(shí)，1／2MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率與MS、KC及VW中的差異性顯著.說(shuō)明1／2MS為白芨種子萌發(fā)的最適基本培養(yǎng)基.

圖2 培養(yǎng)基對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of various culture medium on seed germination in Bletilla striata

2.3 培養(yǎng)基類型及添加物對(duì)萌發(fā)率的影響

為確定培養(yǎng)基類型、椰汁乳對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響，實(shí)驗(yàn)對(duì)1／2MS大組進(jìn)行了仔細(xì)觀察.結(jié)果表明，白芨種子在固體培養(yǎng)上的萌發(fā)較液體培養(yǎng)慢了4～6d，且轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后，生長(zhǎng)較慢，綠色較淡.固體培養(yǎng)基的萌發(fā)率在（41.93±2.41）%～（59.96±6.19）%間，而液體培養(yǎng)基的萌發(fā)率在（47.93±4.79）%～（82.47±8.45）%間（圖3），表明培養(yǎng)基的類型對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響較大.在添加10%椰汁乳條件下，6－BA濃度分別為0.5、1.0、1.5時(shí)，固體培養(yǎng)中白芨種子的萌發(fā)率較液體培養(yǎng)中的分別下降10.87%、22.51%、13.73%，在p＜0.05條件下呈顯著性差異性（圖3），表明在有椰汁乳的情況下，液體培養(yǎng)中的萌發(fā)率大大高于固體培養(yǎng).在6－BA濃度為1.0時(shí)，無(wú)椰汁乳的固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)中白芨種子的萌發(fā)率分別為39.16%、47.93%，較添加椰汁乳的培養(yǎng)基分別降低了20.80%、34.54%，在p＜0.05條件下，白芨種子的萌發(fā)率呈顯著性差異性（圖3），表明培養(yǎng)基中添加椰汁乳可有效提高白芨種子的萌發(fā)率.種子培養(yǎng)30d后的TCC染色，也發(fā)現(xiàn)液體中胚存活率較固體中的胚胎存活率高（圖4）.

圖3 培養(yǎng)基類型及添加物對(duì)萌發(fā)率的影響Fig.3 The effect of culture medium status and Organic amendments on seed germination rate in Bletilla striata

圖4 培養(yǎng)30天后固體和液體培養(yǎng)基中種子活力的比較Fig.4 The comparison seeds vitality after 30days culture in solid and liquid medium in Bletillastriata

2.4 6－BA濃度對(duì)萌發(fā)率的影響

為確定白芨種子萌發(fā)的最適6－BA濃度，實(shí)驗(yàn)對(duì)1／2MS大組進(jìn)行了進(jìn)一步分析.有椰汁乳條件下，當(dāng)6－BA 濃度分別為0.5、1.0、1.5時(shí)，在固體、液體培養(yǎng)基中白芨種子的萌發(fā)率分別為：（41.93±2.41）%、（59.96±6.19）%、（49.20±4.51）%；（52.71±4.44）%、（82.47±8.45）%、（62.93±3.80）%.從中可以看出，液體培養(yǎng)基中的種子萌發(fā)率都較固體的高，提高幅度分別為10.78%、22.51%、13.72%，其 中 6－BA 濃 度 為1.0時(shí)的提高幅度最大（圖3），即為白芨種子萌發(fā)的最適濃度.如不加椰汁乳，在6－BA濃度為1.0時(shí)，固體、液體培養(yǎng)中的白芨萌發(fā)率分別為（39.16±3.48）%、（47.93±4.79）%，提 高 幅 度 僅 為8.77%.表明6－BA對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響在固體和液體中是一致的，但這種影響與椰汁乳的添加有關(guān)，添加椰汁乳可促進(jìn)6－BA對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響，6－BA及椰汁乳對(duì)白芨種子萌發(fā)的促進(jìn)作用間存在互作.

2.5 椰汁乳濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)率及原球莖生長(zhǎng)的影響

為研究6－BA、椰汁乳對(duì)促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的互作作用，在白芨種子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)充了液體培養(yǎng)基中不同椰汁乳濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)率、原球莖鮮重、原球莖長(zhǎng)度的影響實(shí)驗(yàn).在液體培養(yǎng)基中分別添加0、10%、20%、30%、40%的白芨種子萌發(fā) 率 分 別 為 （47.96±4.79）%、（82.47±8.45）%、（91.02±4.35）%、（88.97±5.40）%、（77.61±4.59）%.在p＜0.05條件下，除未添加椰汁乳培養(yǎng)基外，椰汁乳濃度從10%～40%間沒(méi)有顯著性差異.表明椰汁乳對(duì)白芨種子萌發(fā)不存在劑量影響（圖5），但對(duì)白芨種子萌發(fā)后所形成的原球莖鮮重及原球莖長(zhǎng)度存在明顯的影響（圖6，圖7）.當(dāng)椰汁乳濃度為0、10%、20%、30%、40%時(shí)，原球莖的鮮重分別為（0.72±0.06）mg、（1.21±0.10）mg、（1.45±0.09）mg、（1.93±0.13）mg及（1.56±0.06）mg；而原球莖長(zhǎng)度分別為（1.67±0.08）mm、（2.86±0.17）mm、（3.33±0.36）mm、（4.29±0.34）mm、（3.29±0.29）mm.種子萌發(fā)率最高的椰汁乳添加濃度為20%，而原球莖鮮重及原球莖長(zhǎng)度最高的椰汁乳添加濃度是30%，表明椰汁乳對(duì)白芨種子萌發(fā)及促進(jìn)原球莖生長(zhǎng)的濃度要求是不一樣的.

圖5 椰汁乳濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響Fig.5 The effect of coconut water concentration on seed germination in Bletilla striata

圖6 椰子汁濃度對(duì)原球莖鮮重的影響Fig.6 The effect of coconut water concentration on protocorm fresh weight

圖7 椰汁乳濃度對(duì)原球莖長(zhǎng)度的影響Fig.7 The effect of coconut water concentration on Length of protocorm

2.6 無(wú)性繁殖系的構(gòu)建

將原球莖轉(zhuǎn)入擴(kuò)繁培養(yǎng)基培養(yǎng)35d后，觀察到各植物激素配比培養(yǎng)基中原球莖的生長(zhǎng)狀況如表3，原球莖繼代增殖數(shù)如表4.綜合表3、4，A1B2培養(yǎng)基中原球莖顆粒飽滿、呈黃綠色，且無(wú)分化現(xiàn)象、增殖最多，增殖倍數(shù)達(dá)到5.275，為最高增殖倍數(shù).結(jié)果表明A1B2培養(yǎng)基中原球莖的生長(zhǎng)和增殖效果最好，即 MS＋6－BA 1.0mg·L－1＋NAA 0.2mg·L－1為最佳擴(kuò)增繁殖培養(yǎng)基.從中也發(fā)現(xiàn)原球莖增殖較少的激素組合，原球莖會(huì)很快萌發(fā)形成幼苗.因此，在無(wú)性系培養(yǎng)中，如將激 素 設(shè) 定 為 6－BA 1.0mg · L－1、NAA 0.2mg·L－1，可大量擴(kuò)增原球莖；如將激素調(diào)整為6－BA 1.0mg·L－1、NAA 0.8mg·L－1，可獲得白芨幼苗.

表3 不同植物激素配比對(duì)原球莖生長(zhǎng)狀況的影響Table 3 Effects of different plant hormones on the protocorm growth in Bletilla striata

表4 不同植物激素配比對(duì)原球莖繼代增殖數(shù)的影響Table 4 Effects of different plant hormones on protocorm growth and propagation in Bletilla striata

3 討 論

MS是一種高鹽培養(yǎng)基，在白芨種子萌發(fā)時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定毒害作用，從而降低白芨種子萌發(fā)率.選用1／2MS作為種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基，其鹽分較低，比較溫和，有利于萌發(fā).在白芨進(jìn)行叢芽增殖的時(shí)候，富含更多鹽分的MS則更加適合，因?yàn)槟芴峁└嗟酿B(yǎng)分.白芨的蒴果種子在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均達(dá)37.53%以上，少數(shù)種子可能因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中吸收水分不足，而未能萌發(fā).液體培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率均達(dá)48.25%以上，部分接近75.42%，少數(shù)可能因?yàn)榕叩慕Y(jié)構(gòu)不完整而未能萌發(fā)，其余均能萌發(fā).張建霞［20］等發(fā)現(xiàn)蒴果的胚齡越長(zhǎng)，白芨種子的有胚率越高.本實(shí)驗(yàn)所用的種子為已經(jīng)成熟但未開(kāi)裂的白芨蒴果，并且是野外采集的，顯然有胚率較高，故萌發(fā)率高.將固體和液體培養(yǎng)基相比較，液體培養(yǎng)基中種子能更充分的吸收水分和養(yǎng)分，故萌發(fā)率要大大高于固體培養(yǎng)基.

在無(wú)菌播種實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基均添加了單一激素6－BA，并設(shè)計(jì)了濃度梯度（0.5、1.0、1.5），結(jié)果表明：無(wú)論固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基，當(dāng)6－BA濃度為1mg／L時(shí)種子萌發(fā)率最高，這與袁寧［21］、葉靜［22］等的結(jié)果相似，說(shuō)明不同植物激素濃度及配比與原球莖的增殖有很大關(guān)系，原球莖的繼代增殖需要濃度適宜的植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素共同作用［23］.此外，添加椰汁乳也能提高種子萌發(fā)率，并能促進(jìn)原球莖的形成.不同濃度的椰汁乳添加到了培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)不同濃度的椰汁乳不僅可促進(jìn)白芨種子的萌發(fā)，還可提早萌發(fā)時(shí)間，但椰汁乳濃度對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響沒(méi)有顯著性差異（p＜0.05）.此外還發(fā)現(xiàn)椰汁乳可提高白芨原球莖的鮮重及長(zhǎng)度，其中椰汁乳添加濃度為30%時(shí)原球莖鮮重及長(zhǎng)度最為明顯（p＜0.05）（圖6、圖7）.在培養(yǎng)的初期，會(huì)發(fā)現(xiàn)白芨種子緩慢膨脹，在顯微鏡下可觀察到種子內(nèi)包含有一橢圓胚，該階段大約維持1～2周后會(huì)轉(zhuǎn)化為球形胚，隨后球形胚逐步變大突破種皮，仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)球形胚的上部份細(xì)胞分裂旺盛，原球莖變長(zhǎng)并在其上部發(fā)育形成乳頭狀的葉源基（prophyll）組織保護(hù)原球莖上部.此時(shí)的原球莖可肉眼觀察到為小的葉色繁殖體（green propagule），15天后可看到小葉的形成.在添加椰汁乳無(wú)激素的MS中，白芨幼苗在50天時(shí)達(dá)到9.2～15.2mm，但隨后幼苗不生根，也不繼續(xù)生長(zhǎng).而在添加激動(dòng)素（1～4mg·L－16－BA或Kt）或與0.2～1.0mg·L－1NAA 組合會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng).其中6－BA的效果更為明顯，但在幼苗的葉片數(shù)目上未顯示出顯著性差異.

在原球莖擴(kuò)增繁殖實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)兩個(gè)濃度的6－BA（0.5、1.0）和三個(gè)濃度的 NAA（0.2、0.5、0.8）進(jìn)行組合配比，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)選出最適宜原球莖生長(zhǎng)繁殖的組合.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)6－BA濃度為1.0mg·L－1、NAA濃度為0.2mg·L－1時(shí)原球莖生長(zhǎng)繁殖效果最好，即A1B2組合為最佳擴(kuò)增繁殖培養(yǎng)基，而A3B2組合為生長(zhǎng)理想培養(yǎng)基.

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