紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定藏藥藏邊大黃中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌含量△

頓珠次仁 多 吉 嚴(yán)志宏 劉 青 達(dá) 瓦 羅 珍

(西藏藏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中心，西藏 拉薩 850000)

藏邊大黃系蓼科大黃屬波葉組植物Rheum emodi Wall的根與根莖，主要分布在西藏、青海、四川及云南等省，多為野生，西藏部分地區(qū)有種植。其根及根莖的藏名叫曲扎，藏醫(yī)、蒙醫(yī)用于治療胃腸炎、腎炎，外用止血、治瘡、消炎、愈傷口等;大黃供應(yīng)緊張時(shí)，也曾調(diào)往各省區(qū)作大黃使用?！恫厮幹尽份d:藏邊大黃，味酸，苦，性寒，能排出毒家、腑熱和培根病。藏邊大黃含有豐富的蒽醌類(lèi)化合物，如大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等［1］，其具有明顯的抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老以及抗腫瘤等作用［2］。蒽醌類(lèi)化合物在藏邊大黃藥材中以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式存在。本文采用紫外分光光度法，以醋酸鎂的甲醇溶液為顯色劑，通過(guò)比色測(cè)定藏邊大黃中蒽醌類(lèi)成分的含量［3-4］，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)藏邊大黃資源提供參考，也可為制訂其質(zhì)量指標(biāo)提供方法依據(jù)。

1 儀器及試藥

UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司);CPA224S電子分析天平(賽多利斯);醋酸鎂(Mg(Ac)2)、乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇為分析純(廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司)，大黃素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所;藏邊大黃于2013年7月采于西藏拉薩市堆龍德慶縣楚布河上游山坡(海拔4300米)，經(jīng)西藏藏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中心多吉教授鑒定為Rheum emodi Wall。

2 樣品的制備和測(cè)定方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備:取大黃素對(duì)照品精密稱(chēng)量，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液定容配制成 6.132、8.063、9.988、12.036、13.993、16.077、18.12μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2 樣品溶液的制備:①號(hào)供試品溶液，精密稱(chēng)量約0.5g樣品(過(guò)60目)粉末，用索氏提取器三氯甲烷回流提取至提取液無(wú)色，濃縮提取液并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，備用。②號(hào)供試品溶液，精密稱(chēng)量約0.5g樣品(過(guò)60目)粉末，用索氏提取器95%乙醇回流提取至提取液無(wú)色，濃縮提取液并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度。準(zhǔn)確量取10mL溶液置100mL圓底燒瓶中.加熱揮去乙醇，加入30mL硫酸溶液(2.5moL·L-1)加熱回流1.5h，待冷卻后加三氯甲烷20mL，加熱回流2h，待冷卻后置分液漏斗中，用三氯甲烷清洗圓底燒瓶，并入分液漏斗，分離油層和水層，水層繼續(xù)用少量三氯甲烷洗滌4次并人油層，然后用少量蒸餾水洗滌數(shù)次至水層為中性為止，油層置50mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋置刻度，搖勻，備用。

2.3 測(cè)定方法:從①號(hào)和②號(hào)供試品溶液中分別量取等量的2mL至10mL容量瓶中，自然揮去三氯甲烷，各加入0.5%Mg(Ac)2甲醇溶液并稀釋至刻度，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以甲醇為空白，在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度A1和 A2(0.5%Mg(Ac)2，)，依標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算 C1和 C2。(C1為游離蒽醌含量，C2為總蒽醌含量，結(jié)合蒽醌含量=總蒽醌含量一游離蒽醌含量)

2.4 最大吸收波長(zhǎng)選擇:取對(duì)照品大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(9.988μg·mL-1)，在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度，可知溶液的最大吸收波長(zhǎng)為512nm，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察:取對(duì)照品溶液適量，加0.5%Mg(Ac)2 制成濃度分別為 6.132、8.063、9.988、12.036、13.993、16.077、18.12μg·mL-1的對(duì)照品溶液。以 0.5%Mg(Ac)2為空白，測(cè)定各溶液在512nm波長(zhǎng)處的吸光度A，并以濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?；貧w方程為:Y=35.8X+0.0272(r=0.9994)。結(jié)果表明，大黃素的醋酸鎂絡(luò)合物在 6.2-18.1μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.6 精密度試驗(yàn):取大黃素加醋酸鎂甲醇對(duì)照品溶液(16.077μg·mL-1)，在 512nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=0.21%(n=5)。結(jié)果證明此方法精密度很好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn):取大黃素加醋酸鎂甲醇對(duì)照品溶液(16.077μg·mL-1)，分別于 0、2、4、6、8、10、12、14h 測(cè)定512nm吸光度，RSD=0.34010，證明此方法穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn):取藏邊大黃藥材的樣品12份(每份約0.5g)，按“2.2”方法制備并測(cè)定供試品溶液。結(jié)果，游離蒽醌平均含量為0.652%(RSD=1.52%，n=6)，總蒽醌平均含量為 5.38%(RSD=2.83%，n=6)。

2.9 總蒽醌加樣回收率試驗(yàn):精密稱(chēng)取3份總蒽醌含量已知的藏邊大黃藥材(總蒽醌含量為5.43%)，每份約0.3g，另精密稱(chēng)定對(duì)照品大黃素 0.84mg、11.38mg 和 15.69mg，將此3份對(duì)照品分別加入3份樣品中，按“2.2”項(xiàng)下②號(hào)供試品溶液制備方法制備并測(cè)定。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率為 99.8%(RSD=2.94%)。

3 樣品測(cè)定

取藏邊大黃藥材粉末(過(guò)60目)4份(每份約0.5g)，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，兩份測(cè)定游離蒽醌，兩份測(cè)定總蒽醌，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中蒽醌含量，結(jié)果見(jiàn)表1。平均結(jié)合蒽醌含量=平均總蒽醌含量一平均游離蒽醌含量=4.732%)。

表1 藏邊大黃樣品當(dāng)中游離蒽醌和總蒽醌的測(cè)定結(jié)果表

4 討論紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定蒽醌含量常用兩種方法，分別是堿液法和醋酸鎂法，堿液法蒽醌一般在0.5h吸光度最大，th后出現(xiàn)緩慢衰減;醋酸鎂法在1.5h內(nèi)吸光度比較穩(wěn)定，同時(shí)醋酸鎂法較堿液法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好。

［1］劉兵，楊靜，王署.藏邊大黃的化學(xué)成分研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22(1):033-035.

［2］李軍林，王志斌，李家實(shí)，藏邊大黃降血糖作用的研究［J］.中藥材，1997，20(5):249-250.

［3］姚桂根，孫小萍，馬星航，等.用醋酸鎂一甲醇比色法測(cè)定何首烏及其制劑中蒽醌類(lèi)成分的含量［J］.中草藥，1983，14(6):15-18.

［4］高言明，陳海云，吳小宇.醋酸鎂一甲醇分光光度法測(cè)定何首烏中蒽醌類(lèi)化合物的含量［J］.微量元素與健康研究，20104，(2):41-42.0