MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗中的比對分析

張娟 蔣俊 張紅 賈琳 魏成翠 石蓮 馬靜紅 楊立軍

(1.遼寧省沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實驗室 沈陽 110044;2.遼寧省結(jié)核病防治所 沈陽 110005)

MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗中的比對分析

張娟1蔣俊1張紅1賈琳1魏成翠1石蓮1馬靜紅1楊立軍2

(1.遼寧省沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病實驗室 沈陽 110044;2.遼寧省結(jié)核病防治所 沈陽 110005)

目的比對全自動Bactec MGIT960(MGIT960)系統(tǒng)與改良羅氏(L-J)培養(yǎng)方法2者在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗中的優(yōu)越性>。方法按國家疾病預(yù)防控制中心(CDC)-碧迪項目遼寧工作方案要求和國際標(biāo)準(zhǔn)WS288-2009《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》納入臨床病例。本實驗共納入病例435例,其中男性319例,女性116例,平均年齡52.3歲(10～86歲)。上述每份病例標(biāo)本均分別進(jìn)行痰液涂片抗酸染色(萋-尼法)鏡檢,L-J固體培養(yǎng)和MGIT960系統(tǒng)液體培養(yǎng)。培養(yǎng)陽性者分別進(jìn)行一線藥物異煙肼(INH)、利福平(RIF)、鏈霉素(STR)和乙胺丁醇(EMB)的L-J法藥敏試驗(比例法)和MGIT960藥敏試驗;分別計算出抗酸染色鏡檢與MGIT960和 L-J培養(yǎng)的符合率;L-J培養(yǎng)和MGIT960培養(yǎng)陽性檢出率;L-J和MGIT960兩種培養(yǎng)方法藥敏試驗所需的培養(yǎng)時間及符合率等>。結(jié)果MGIT960培養(yǎng)法和 L-J培養(yǎng)法與痰涂片鏡檢的陽性符合率分別為 90.8%(187/206)和89.3%(184/206);MGIT960與L-J結(jié)果符合率92.8%(219/236);MGIT960和L-J平均培養(yǎng)時間分別為9.5 d和31.5 d;MGIT960和L-J一線藥物INH、RIF、STR和EMB敏感性試驗的符合率分別為92.7%、95.9%、91.8%和97.3%>。結(jié)論全自動MGIT960系統(tǒng)培養(yǎng)方法的敏感度和特異度高于L-J培養(yǎng)法,報告時間平均縮短至9.5 d,該系統(tǒng)是目前最為理想的快速結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗檢測系統(tǒng)。

分枝桿菌,結(jié)核;微生物敏感性試驗;細(xì)菌學(xué)技術(shù)

2009年12月,本院接受遼寧省疾病預(yù)防控制中心委托,對Bactec MGIT 960(MGIT 960)系統(tǒng)和改良羅氏(L-J)兩種培養(yǎng)方法在結(jié)核分枝桿菌(tubercle bacillus,TB)培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感性試驗中進(jìn)行了比對實驗,以期對2者在實驗中的優(yōu)越性給予探討和評價。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本納入

1.1.1 病例納入 根據(jù)國家 CDC-碧迪(Becton Dickinson,BD)項目遼寧工作方案的要求,本實驗嚴(yán)格按國際標(biāo)準(zhǔn)WS288-2009《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》,臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查確診或高度疑似的肺結(jié)核患者收集痰液標(biāo)本進(jìn)行實驗室的痰涂片鏡檢、MGIT960和 L-J分離培養(yǎng)、菌株(種)鑒定以及藥物敏感性試驗等工作。本實驗項目共納入上述病例435例,其中男性319例,女性 116例,平均年齡52.3歲,最小年齡10歲,最大年齡86歲。

1.1.2 標(biāo)本接收 上述435例實驗標(biāo)本均是經(jīng)過實驗室目視或鏡檢確認(rèn)的合格標(biāo)本(每例2～3份),多數(shù)為黏液痰、干酪痰或含有少量新鮮血液的血痰。液體量約3～10 ml。不合格標(biāo)本棄之,并建議臨床重新留取再檢。

1.2 儀器試劑

1.2.1 實驗儀器 全自動 BACTECTMMGITTM960TB系統(tǒng),購置于美國BD公司。

1.2.2 液體培養(yǎng)基 MGITTM960液體培養(yǎng)基(管),MGIT生長添加劑(grow th supplement),MGIT雜菌抑制劑(PANTA)均購置于美國BD公司。

1.2.3 固體培養(yǎng)基 改良羅氏(L-J)固體培養(yǎng)基為本室參照文獻(xiàn)[1]制備。

1.2.4 消化(去污染)液 氫氧化鈉(NaOH)-N-乙?；?L-半胱氨酸(NALC)、NaOH 溶液、磷酸鹽緩沖液(pH 6.8,0.067 M)按BD工作方案制備,其中NALC購置于美國BD公司。

1.2.5 抗酸染液 抗酸染色液,購置于貝索(BaSO)生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 痰液涂片 將接收的痰液標(biāo)本在Ⅱ級生物安全柜內(nèi),按序編號(如：LN0001)后,以接種環(huán)盡可能挑取膿樣或干酪樣痰液標(biāo)本約0.08ml,均勻涂抹于載玻片非磨砂面中間約15 mm左右(橢圓形),自然干燥待萋-尼(Z-N)抗酸染色及鏡檢。

1.3.2 接種培養(yǎng) 將上述痰涂片后余下標(biāo)本經(jīng)消化處理后,分別接種至 L-J和MGIT 960培養(yǎng)基(管)內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.3 痰涂片鏡檢 經(jīng)抗酸染色的涂片按要求觀察300個視野尋找抗酸陽性TB。

1.3.4 菌種鑒定 培養(yǎng)陽性者均以鑒別培養(yǎng)基對其菌種進(jìn)行鑒定,將非結(jié)核分枝桿菌除外。

1.3.5 藥敏試驗 分別對MGIT 960液體和L-J固體培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行一線藥物異煙肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampicin,RIF)、鏈霉素(Streptomycin,ST R)和乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)的敏感性試驗。

1.4 菌株保存

1.4.1 菌株傳代 對上述培養(yǎng)陽性菌株均進(jìn)行傳代培養(yǎng),以作備株(菌株)。

1.4.2 菌株凍存 將上述傳代的備株轉(zhuǎn)移至1.8 ml(含 50%甘油)的甘油-鹽水液中,-80℃凍存。

1.5 資料統(tǒng)計

1.5.1 原始記錄 詳細(xì)記錄標(biāo)本編號、標(biāo)本性狀、送檢日期、菌種鑒定、痰涂片鏡檢、培養(yǎng)(L-J和MGIT 960)及藥敏試驗結(jié)果等。陽性標(biāo)本及相關(guān)背景資料(電子版本)妥善保存,備檢。

1.5.2 背景資料 查閱并記錄患者自然情況,首次確診時間、地點及臨床診斷,臨床癥狀(并發(fā)癥),病例分類(新發(fā)或復(fù)發(fā)),以及治療、接觸史等。

1.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 分別統(tǒng)計抗酸染色鏡檢與MGIT 960和L-J培養(yǎng)符合率;MGIT 960和L-J培養(yǎng)符合率;MGIT 960和 L-J培養(yǎng)陽性檢出率及污染率;臨床診斷、痰涂片鏡檢、L-J和MGIT 960之間結(jié)果的差異;MGIT960與L-J兩種培養(yǎng)方法藥敏的培養(yǎng)時間及符合率等。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片與MGIT 960和L-J培養(yǎng)

2.1.1 符合率 痰涂片鏡檢與MGIT 960和L-J培養(yǎng)陽性(+)符合率較高,分別為90.8%(187/206)和89.3%(184/206)。

2.1.2 培養(yǎng)時間 MGIT 960和 L-J兩者培養(yǎng)平均時間分別為9.5 d(6.2～12.8 d)和31.5 d(27～36 d),兩者平均相差22 d(表1)。

2.2 MGIT960和L-J培養(yǎng)

2.2.1 符合率 MGIT960和L-J兩種方法培養(yǎng)標(biāo)本共同陽性219份,陰性156份,符合率為93.8%(375/400)。

2.2.2 污染率 MGIT960和L-J兩種方法共同培養(yǎng)的435份標(biāo)本中,MGIT 960污染率5.1%(22/435);L-J培養(yǎng)污染率 4.6%(20/435)(表2)。

2.3 實驗各組分組統(tǒng)計 臨床診斷、痰涂片鏡檢、MGIT960和 L-J培養(yǎng)均為陽性(+)者占44.3%(177/400);僅痰涂片陰性者占10.5%(42/400);臨床診斷結(jié)核,但涂片和培養(yǎng)均陰性(-)者占37.5%(150/400)(表3)。

表1 痰涂片染色MGIT 960和L-J培養(yǎng)方法陽性符合率及平均培養(yǎng)時間比較a

表2 L-J和MGIT 960培養(yǎng)方法檢測結(jié)果比較(份)a

表3 臨床標(biāo)本400份TB培養(yǎng)結(jié)果分組統(tǒng)計表a

2.4 MGIT960和L-J培養(yǎng)方法藥敏

2.4.1 符合率 MGIT960和L-J兩種培養(yǎng)方法一線藥敏試驗標(biāo)本220份,INH、RIF、STR和EMB兩種方法的符合率分別為：92.7%(204/220)、95.9%(211/220)、91.8%(202/220)和 97.3%(214/220)。

2.4.2 試驗時間 MGIT 960和 L-J兩種方法藥敏試驗平均測定所需時間分別為8.5 d(6～14 d)、28.5 d(28～42 d),兩者相差20 d。

2.4.3 耐藥及敏感符合率 L-J和MGIT 960藥敏試驗兩者一線藥物INH、RIF、STR和EMB的耐藥和敏感符合率分別為：87.7%(93/106)和89.8%(114/127)、97.8%(87/89)和 98.5%(131/133)、98.9%(87/88)和 99.2%(132/133)、75.0%(30/40)和 94.7%(180/190),見表 4。

表4 不同藥物采用L-J和MGIT960兩種方法對220份標(biāo)本藥敏試驗的結(jié)果比較(份)a

3 討論

1931年Lowenstein和1932年Jensen發(fā)明的羅氏培養(yǎng)基(L-J)目前廣泛應(yīng)用于分離TB,并作為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。但由于TB生長緩慢而難以培養(yǎng),一般情況下L-J培養(yǎng)需4～8周的時間,給臨床的及時診斷帶來不便。長期以來,人們在不斷地探索新的快捷的診斷方法。1996年美國BD公司繼1977年研制出Bactec 460 TB系統(tǒng)后,又研制出Bactec MGIT 960分枝桿菌全自動快速培養(yǎng)儀。該系統(tǒng)采用在專用 7H9培養(yǎng)管中加入含有Ruthenium的熒光底物,而當(dāng)檢測標(biāo)本有分枝桿菌存在時,其代謝產(chǎn)物激發(fā)底物產(chǎn)生熒光,從而避免了Bactec 460 TB系統(tǒng)C14標(biāo)記的含有放射性物質(zhì)培養(yǎng)基所帶來一定程度的放射性污染。人們對此頗感振奮并做過許多相關(guān)研究。Bird等[3]認(rèn)為,快速并最大程度地實現(xiàn)臨床標(biāo)本中分枝桿菌的檢出,使用液體培養(yǎng)基的趨勢在逐漸增強(qiáng)。本研究將MGIT960與L-J兩種培養(yǎng)方法進(jìn)行比對實驗,進(jìn)一步佐證了這一論點。

本研究結(jié)果顯示：(1)MGIT960培養(yǎng)法和L-J培養(yǎng)法與痰涂片鏡檢的陽性符合率高,分別為90.8%(187/206)和 89.3%(184/206)。(2)MGIT960“涂陽培陰”率3.4%(7/206)低于 L-J的6.3%(13/206),顯示了 MGIT960有更高的敏感度。(3)MGIT960培養(yǎng)時間較L-J培養(yǎng)時間平均縮短22 d,這一結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)報道相近似[4],充分展示了MGIT960快速檢測報告的絕對優(yōu)勢。(4)MGIT960與 L-J結(jié)果符合率高達(dá) 93.8%(375/400),可見MGIT960培養(yǎng)方法與“金標(biāo)準(zhǔn)”L-J培養(yǎng)方法具有很高的一致性。(5)臨床診斷、痰涂片鏡檢、L-J培養(yǎng)陽性(+),MGIT960培養(yǎng)陰性(-)為0,體現(xiàn)了MGIT960培養(yǎng)方法具有很高的敏感度和特異度。(6)MGIT960和L-J培養(yǎng)法一線藥敏的符合率平均為 94.4%,兩者如此高的符合率,說明MGIT 960藥敏試驗并不遜色于 L-J藥敏試驗,MGIT 960二線藥物敏感試驗的研究宜抓緊進(jìn)行。(7)臨床診斷、L-J和MGIT960培養(yǎng)陽性(+),痰涂片鏡檢陰性(-)者為42例,占10.5%(42/400),再次反映出痰涂片鏡檢受多因素影響的局限性。(8)臨床診斷陽性(+),而痰涂片鏡檢、L-J和MGIT960均陰性(-)者為37.5%(150/400),這一現(xiàn)象可能與標(biāo)本留取質(zhì)量、非排菌患者、肺外結(jié)核、臨床用藥治療、臨床診斷等多因素有關(guān),關(guān)于此點有待進(jìn)一步深入探討和研究。

綜合上所述,Bactec MGIT 960系統(tǒng)對于結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)、鑒定和一線藥敏試驗與“金標(biāo)準(zhǔn)”L-J培養(yǎng)法比較具有其自身敏感度和特異度俱佳及培養(yǎng)時間短的獨特優(yōu)勢,是目前 TB培養(yǎng)其他試驗方法無可比擬的。其弱點是設(shè)備價格較為昂貴,目前在我國基層醫(yī)療單位普及應(yīng)用尚有一定困難。有條件的單位,應(yīng)用 MGIT960TB系統(tǒng)將為實驗室TB檢測的快速、準(zhǔn)確報告提供保證。

[1]中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[S].北京：中國教育文化出版社,2006：30-37.

[2]吳雪瓊,張宗德,樂軍.分枝桿菌分子生物學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2010：2-3.

[3]Bird BR,Denniston MM,Huebner RE,Good RC.Changing practices in mycobacteriology：a follow-up survey of state and territorial public health labo ratories[J].J Clin Microbiol,1996,34(3)：554-559.

[4]王巍,李洪敏,王安生,吳雪瓊,王仲元,劉金偉,陳紅兵,林明貴,王金河,李靜,仲斌,丹子軍,張韜,李素梅.BACT EC-MGIT 960快速培養(yǎng)藥敏對肺結(jié)核診治的應(yīng)用和評價[J].中國防癆雜志,2003,25(6)：379-381.

Comparing analysis of Mycobacterium Bactec MGIT960 culture with Lowenstein-Jensen culture method

Zhang Juan1,Jiang Jun1,Zhang Hong1,Jia Lin1,Wei Chengcui1,Shi Lian1,Ma Jinghong1,Yang Lijun2
(1.TB Laboratory of Shenyang Chest Hospital,Shenyang110044,China;2.Tuberculosis Control Institution of Liaoning Province,Shenyang110005,China)

ObjectiveT o compare the using value of the automatic BACTEC MGIT960 system with Lowenstein-Jensen(L-J)culture method in culture,identification and drug susceptibility test of Mycobacterium.MethodsA total of 435 cases(including 319 male patients and 116 female patients with average age 52.3 years)were detected by sputum smear for acid-fast staining,L-J culture and MGIT960 liquid culture,respectively.The culture-positive samples were further performed drug susceptibility test on isoniazid(INH),rifampicin(RIF),streptomycin(ST R)and ethambutol(EMB)using the absolute concentration method on L-J medium and MGIT960 method,respectively.Their culture-positive rate,culture time and coincidence rate were analyzed.ResultsThe positive coincidence rate of MGIT960 and L-J culture with sputum smear were 90.8%(187/206)and 89.3%(184/206),respectively.The coincidence rate of MGIT960 and L-J culture was 92.8%(219/236).Their average culture times were 9.5 days and 31.5 days,respectively.The co-incidence rate of INH 、RIF 、STR and EMB drug susceptibility test using MGIT960 and L-J culture method was 92.7%,95.9%,91.8%and 97.3%,respectively.ConclusionsT he sensitivity and specificity of automatic MGIT960 are higher than L-J method.The report time of MGIT960 reduced to 9.5 days.The automatic MGIT960 is ideal for the rapid mycobacterial culture,identification and drug susceptibility test.

Mycobacterium tuberculosis;microbial senstivity tests;bacteriological techniques

Jiang Jun(xkyyjykjj@sina.com)

蔣俊(xkyyjykjj@sina.com)

2011-03-11)

(本文編輯：薛愛華)