GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系

王妨娥，凌 敏，白 杰，茍安栓，錢建輝，趙宗峰

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的特征為不完全可逆的氣流受限，氣流受限通常是與肺部異常炎癥反應(yīng)的有害顆粒或氣體有關(guān)［1］。Thakur et al［2］研究報(bào)告已經(jīng)證實(shí)蛋白酶-抗蛋白酶和氧化酶-抗氧化酶的失平衡是導(dǎo)致COPD的主要因素。氧化酶-抗氧化酶失平衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可以損害氣道上皮組織和肺間質(zhì)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，使促炎癥細(xì)胞因子基因上調(diào)，進(jìn)而影響COPD的發(fā)生和發(fā)展。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)作為其中的抗氧化酶在肺部起著保護(hù)作用，可以催化各種與還原型谷胱甘肽共軛的電化合物。因此，COPD的發(fā)展機(jī)制中可能不僅僅包括蛋白酶-抗蛋白酶失平衡，也有氧化酶-抗氧化酶失平衡的參與。很多研究［3－6］表明，COPD與GSTs的相關(guān)性存在民族和地域的差異。由于地理位置特殊，冬季漫長(zhǎng)，氣候寒冷，COPD是新疆地區(qū)常見的呼吸系統(tǒng)疾病。凌敏 等［7］對(duì)新疆農(nóng)村地區(qū)COPD危險(xiǎn)因素調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，維吾爾族和哈薩克族人群中COPD患病率較高。鑒于GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性的分布在不同民族及地區(qū)間存在較大差異，且與新疆維吾爾族COPD的相關(guān)性研究未見相關(guān)報(bào)道，因此，該研究對(duì)GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究，并與其他種族進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年8月～2013年8月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科住院治療的新疆維吾爾族COPD患者80例(COPD組)，均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)［1］，選擇年齡、性別匹配的本院健康體檢者80例為對(duì)照組，且肺功能符合以下指標(biāo):第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)＞70%，F(xiàn)EV1≥80%預(yù)計(jì)值，兩組均排除支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺部腫塊、結(jié)核性胸膜炎、胸廓畸形、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病及其他感染性疾病、外傷及自身免疫性疾病。兩組年齡及性別均無(wú)顯著差異，具有可比性。兩組均為無(wú)民族間遺傳干擾(與其他民族人無(wú)通婚情況)、無(wú)血緣關(guān)系的連續(xù)兩代及以上長(zhǎng)期居住于新疆的維吾爾族人群，所有受試者均簽署書面的志愿書，該研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，GSTM1、GSTT1及白蛋白3對(duì)引物合成、Taq 酶、10 × Buffer、dNTP、ddH2O 均購(gòu)于北京鼎國(guó)生物科技有限公司，DNA Marker購(gòu)于BBI公司，DMSO購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，其他均為分子生物學(xué)常規(guī)試劑。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本采集 在清晨空腹時(shí)采集研究對(duì)象的靜脈血2 ml，EDTA抗凝，將抗凝管上下輕輕顛倒8～10次，使血液與抗凝劑充分混合，－20℃低溫保存。

1.3.2 基因組DNA提取 利用全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，按照廠家提供的說(shuō)明書方法提取全血基因組DNA。提取的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 多重PCR法檢測(cè)GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性 依據(jù)文獻(xiàn)合成GSTM1、GSTT1及白蛋白3對(duì)引物［6］，其中白蛋白為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照。3對(duì)引物序列如下，GSTM1上游引物:5'-GAACTCCCTGAAAAGC TAAAGC-3'，下游引物:5'-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3';GSTT1上游引物:5'-TTCCTTACTGGTCC TCACATCTC-3，下游引物:5'-TCACCGGATCATGG CCAGCA-3';白蛋白上游引物:5'-GCCCTCTGCTAA CAAGTCCTAC-3'，下游引物:5'-GCCCTAAAAAGA AAATCGCCAATC-3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μl):10 × Tap Buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 2 μl，10 μmol/L 3 對(duì)上、下游引物各 0.5 μl，Taq 酶 5 U，50 ng/μl人基因組 DNA 1 μl，DMSO 1 μl，超純水補(bǔ)足20 μl;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;接著進(jìn)行擴(kuò)增，包括94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán);然后72℃延伸5 min，最后4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并判別基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示;年齡、吸煙指數(shù)(用年吸煙包數(shù)表示:平均每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)/20)，均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);各組間基因型和等位基因頻率的比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度采用χ2檢驗(yàn);多因素調(diào)整采用Logistic回歸分析，計(jì)算比值比(odds ratios，OR)和95%可信區(qū)間 (confidence intervals，CI)用來(lái)檢測(cè) GSTM1、GSTT1與 COPD的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較 兩組資料在性別(男 ∶女比例為44∶36和41∶39)和年齡(平均年齡54.4±15.2和54.5±12.0)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間吸煙指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間FEV1預(yù)計(jì)值及FEV1/FVC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 GSTM1、GSTT1基因純合缺失的檢測(cè)結(jié)果

所有樣本均能在350 bp處擴(kuò)增出陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照白蛋白目的條帶，480 bp處出現(xiàn)一條帶為GSTM1純合缺失型;215 bp處出現(xiàn)一條帶即為GSTT1純合缺失型;只出現(xiàn)一條白蛋白對(duì)照條帶為GSTM1、GSTT1同時(shí)為純合缺失型;在480 bp和215 bp出現(xiàn)兩條帶為GSTM1、GSTT1非純合缺失型，見圖1。

圖1 GSTM1、GSTT1基因多重PCR分析結(jié)果

2.3 GSTM1、GSTT1基因型在COPD組和對(duì)照組之間的分布差異 如表1所示新疆維吾爾族COPD組GSTM1純合缺失型基因型頻率(70.0%)高于對(duì)照組的頻率(51.3%)(P=0.015);GSTT1基因純合缺失型頻率在COPD組(40.0%)與對(duì)照組(21.3%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01);GSTM1、GSTT1基因純合缺失型的基因頻率在COPD組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.002)。以研究對(duì)象是否患COPD為因變量經(jīng)Logistic回歸分析(協(xié)變量包括年齡、性別、吸煙史、GSTM1及GSTT1基因型)，經(jīng)調(diào)整年齡、性別和吸煙史后，發(fā)現(xiàn)GSTM1基因純合缺失型則為COPD的危險(xiǎn)因素 (OR=2.22，95%CI:1.16 ～4.25，P=0.016);GSTT1基因純合缺失型為COPD的危險(xiǎn)因素(OR=2.47，95%CI:1.23 ～ 4.97，P=0.011)，GSTM1、GSTT1同時(shí)為純合缺失型則為COPD的危險(xiǎn)因素(OR=4.67，95%CI:1.65～13.14，P=0.004)。

表1 GSTM1、GSTT1基因型在COPD組和對(duì)照組之間的分布差異［n=80，n(%)］

2.4 比較不同種族COPD組和對(duì)照組GSTM1、GSTT1基因型分布 由表2可見，GSTM1純合缺失型在哈薩克族、維吾爾族、北印度人和突尼斯人群中COPD組及對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GSTT1純合缺失型、GSTM1、GSTT1同時(shí)純合缺失型在維吾爾族人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而漢族人群中3種基因型在COPD組和對(duì)照組中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組GSTM1、GSTT1基因型分布［n(%)］

3 討論

COPD 是多基因參與的復(fù)雜疾病，多個(gè)基因的多態(tài)性在COPD的易感性方面可能相互作用。氧化－抗氧化失衡是機(jī)體患COPD的一個(gè)主要發(fā)病機(jī)制，而抗氧化酶在其中起著重要作用。GSTs是一個(gè)超家族的酶系，參與許多親電子致癌物的解毒過(guò)程，在很多外源性化合物和藥物的解毒過(guò)程起著重要的作用［1］，從而起著保護(hù)肺組織的作用。

本研究首次分析了新疆維吾爾族人群GSTM1、GSTT1與 COPD易感性的關(guān)系。提示 GSTM1、GSTT1基因與新疆維吾爾族人群的COPD有顯著的相關(guān)性。對(duì)照組與COPD組對(duì)比結(jié)果提示GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型、GSTM1、GSTT1同時(shí)為純合缺失型時(shí)是COPD的危險(xiǎn)因素，在除去COPD的主要危險(xiǎn)因素后，兩組間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型是COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果提示GSTM1純合缺失型、GSTT1純合缺失型可能和COPD易感性相關(guān)。Shuk et al［4］在北印度人群中研究表明:GSTM1純合缺失型基因?yàn)镃OPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。馬志明 等［8］對(duì)中國(guó)漢族人群研究發(fā)現(xiàn)GSTM1純合缺失基因型可能增加了長(zhǎng)期大量吸煙人群對(duì)COPD的易感性，若同時(shí)伴有GSTT1的純合缺失型基因可進(jìn)一步增加對(duì)COPD的易感性。Smolonska et al［9］在亞洲人群中采用 Meta分析時(shí)發(fā)現(xiàn)GSTM1基因純合缺失型為COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但進(jìn)行分層分析后發(fā)現(xiàn)GSTM1基因純合缺失型可能不是COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此前，楊瑞紅 等［10］研究報(bào)道，GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與漢族人群COPD易感性沒有相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因之間有明顯的協(xié)同作用。Lakhdar et al［5］沒有發(fā)現(xiàn)GSTM1基因多態(tài)性和突尼西亞人群COPD有獨(dú)立相關(guān)性。本課題組的前期研究［6］中也沒有發(fā)現(xiàn)GSTM1基因多態(tài)性與新疆哈薩克族人群的COPD有獨(dú)立相關(guān)性。這說(shuō)明GSTM1、GSTT1基因在不同人群中的作用機(jī)制或?qū)OPD的影響不同，可能與種族、地域等差異有關(guān)。這些研究結(jié)果提示，各地區(qū)各民族之間GSTM1、GSTT1基因分布確實(shí)存在差異。這可能是一些相關(guān)疾病在不同種族、不同區(qū)域間具有的不同發(fā)病率和臨床特點(diǎn)的主要原因。

有研究［10］顯示，攜帶GSTT1基因純合缺失型的人群比攜帶GSTT1非純合缺失型可能更容易導(dǎo)致具有遺傳毒性和肺部疾病，這可能與GSTT1在肺部沒有表達(dá)有關(guān)。近年來(lái)研究［11－13］證明COPD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在全身炎癥反應(yīng)和全身性氧化應(yīng)激反應(yīng)。GSTT1可能通過(guò)參與拮抗全身性氧化應(yīng)激的過(guò)程，起到一定的抗氧化作用。有研究［14］報(bào)道GSTM1基因純合缺失型及其他參與抗氧化過(guò)程基因的變異(例如GSTP1和環(huán)氧化物水解酶)是COPD的危險(xiǎn)因素。因此，在今后的研究中，需擴(kuò)大樣本量及增加其它參與氧化－抗氧化酶的研究(例如GSTP1或環(huán)氧化物水解酶等)，以尋找出效度較高的COPD易感性遺傳標(biāo)記，以期為COPD防治提供新思路、新策略。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36(4):1－10.

［2］Thakur H，Gupta L，Sobti R C，et al.Association of GSTM1、T1 genes with COPD and prostate cancer in north Indian population［J］.Mol Biol Rep，2011，38(3):1733 －9.

［3］Xue H，Su J，Sun K，et al.Glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphism and COPD risk in smokers:an updated analysis［J］.Mol Biol Rep，2012，39(4):5033 －42.

［4］Shuk R K，Kant S，Bhattacharya S，et al.Association of genetic polymorphism of GSTT1，GSTM1 and GSTM3 in COPD patients in a north Indian population［J］.COPD，2011，8(3):167 － 72.

［5］Lakhdar R，Denden S，Knani J，et al.Association of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease in a tunisian population［J］.Biochem Genet，2010，48:647 － 57.

［6］安海燕，凌 敏，茍安栓，等.谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶M1、T1基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(6):451－2.

［7］凌 敏，榮 艷，茍安栓，等.新疆農(nóng)村地區(qū)慢性阻塞性肺疾病危險(xiǎn)因素調(diào)查［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(9):666－9.

［8］馬志明，張珍祥，韓澤民，等.GSTM1和 GSTT1基因多態(tài)性與COPD易感性的研究［J］.中國(guó)醫(yī)師雜志，2004，6(6):721－4.

［9］Smolonska J，Wijmenga C，Postma D S，et al.Meta-analyses on suspected chronic obstructive pulmonary disease genes:a summary of 20 year's research［J］.Am J Respir Crit Care，2009，180(7):618－31.

［10］楊瑞紅，何權(quán)瀛，盧冰冰，等.谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1、T1基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性關(guān)系的研究［J］.中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2004，3(2):79 －82.

［11］Cantlay A M，Smith C A，Wallace W A，et al.Heterogenous expression and polymorphic genotype of glut athi one S transferases in human lung［J］.Thorax，1994，49(10):1010 －4.

［12］Noguera A，Busquets X，Sauleda J，et al.Expression of adhesion molecules and G proteins in circulating neutrophils in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Cirt Care Med，1998，158(5 Pt1):1664－8.

［13］Rahman I，Morrison D，Donaldson K，et al.Systemic oxidative stress in asthma，COPD，and smokers［J］.Am J Respir Crit Care Med，1996，154(4 Pt1):1055－60.

［14］Lakhdar R，Denden S，Mouhamed M H，et al.Correlation of EPHX1，GSTP1，GSTM1，and GSTT1 genetic polymorphisms with anti oxidative stress markers in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Exp Lung Res，2011，37(4):195 －204.