胰島β細(xì)胞功能衰退之謎？——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在β細(xì)胞功能衰退中的作用

解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科 母義明

胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病(T2DM)的兩大發(fā)病機(jī)制[1]。研究顯示，胰島素抵抗早期即可發(fā)生，與非肥胖的正常糖耐量(NGT)者相比，肥胖的NGT者的胰島素敏感性已經(jīng)下降了29%，肥胖的葡萄糖耐量異常(IGT)者的胰島素敏感性進(jìn)一步下降28%，而β細(xì)胞功能衰退的發(fā)生及速度則決定了糖尿病的發(fā)病及進(jìn)程[2]。因此，胰島素抵抗可能是T2DM發(fā)生的始動因素，當(dāng)胰島β細(xì)胞功能不能繼續(xù)代償胰島素生理需求時血糖開始升高，最終進(jìn)展為糖尿病[3]，其中胰島素的早相分泌喪失發(fā)生較早，而各種因素所導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞數(shù)量減少及功能紊亂是糖尿病致病機(jī)制的核心[4]。

胰島β細(xì)胞衰退的揭秘

2013年第49屆歐洲糖尿病研究學(xué)會(EASD)學(xué)術(shù)年會上將第48 屆Minkowski獎授予來自比利時布魯塞爾大學(xué)(ULB)伊拉斯姆斯醫(yī)院的Miriam Cnop教授，以表彰她長期致力于β細(xì)胞功能基礎(chǔ)研究的巨大貢獻(xiàn)。

Miriam Cnop教授的研究小組一直關(guān)注胰島β細(xì)胞及凋亡在單基因糖尿病及T2DM發(fā)病中的作用，闡明了游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應(yīng)激在FFA誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，并積極尋找能保護(hù)β細(xì)胞的治療靶標(biāo)及干預(yù)策略。

1.T2DM的一級親屬早期即存在胰島β細(xì)胞功能的減退

Cnop等[5]研究在33名T2DM患者的非糖尿病一級親屬中連續(xù)7年采用靜脈及口服葡萄糖耐量試驗觀察其胰島素敏感性(insulin sensitivity，SI)、β細(xì)胞功能、葡萄糖自身代謝效應(yīng)(glucose effectiveness，Sg)及葡萄糖耐量情況，結(jié)果顯示受試者的體重和腹圍雖然逐漸增加，但其SI、葡萄糖刺激后急性胰島素反應(yīng)(AIRg)、Sg并未見顯著變化。然而當(dāng)調(diào)整了胰島素敏感性對胰島素釋放的作用后，作為反映β細(xì)胞功能的葡萄糖處置指數(shù) [disposition index，DI(=AIRg*SI)]下降了22%(P<0.05)。初始評估為NGT的受試者，在之后的隨訪中有部分進(jìn)展為IGT，與未進(jìn)展為IGT的受試者相比，那些進(jìn)展為IGT的受試者的DI下降達(dá)50%(P<0.05)。因此提示，T2DM的一級親屬的糖耐量減低與β細(xì)胞功能減退相關(guān)。

2.β細(xì)胞功能喪失的關(guān)鍵是β細(xì)胞的衰亡增加而并非增生能力下降

與嚙齒類動物不同，隨著年齡增加，人和哺乳動物的許多組織細(xì)胞尤其是那些氧化應(yīng)激水平較高、壽命較長的組織細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞內(nèi)的脂褐素小體(lipofuscin bodies，LBs))沉積增加。在胰島細(xì)胞，不僅線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜經(jīng)自噬作用(autophagy)發(fā)生溶酶體酶解退化，而且過量的分泌顆粒及細(xì)胞內(nèi)膜也發(fā)生酶解退化，從而使胰島β細(xì)胞內(nèi)的色素及金屬離子在細(xì)胞內(nèi)堆積，形成LBs，因此LBs的沉積代表著廢物的貯存并聚集在細(xì)胞內(nèi)而不能運送出細(xì)胞外。細(xì)胞內(nèi)LBs沉積的速率、大小及成分與細(xì)胞活動如ER應(yīng)激、線粒體更新、分泌顆粒降解等有關(guān)，所以評估脂褐素沉積的量可以作為細(xì)胞老化和細(xì)胞壽命的標(biāo)志。人類尸檢的電鏡標(biāo)本顯示，在生命早期(1歲)時胰島β細(xì)胞內(nèi)就有脂褐素沉積存在，隨年齡增加β細(xì)胞LBs沉積量顯著增加，胰島內(nèi)含有LBs的β細(xì)胞比例也有增加。在其他靈長類動物如猴子(5～30歲)的研究中也有相似的結(jié)果。但作為嚙齒類的小鼠試驗的結(jié)果則顯示細(xì)胞內(nèi)LBs的含量不足人類的10%，只在60周齡以上的小鼠細(xì)胞內(nèi)LBs才有所增加。然而人體內(nèi)分裂旺盛的細(xì)胞，如人類胰島瘤細(xì)胞中的LBs含量也表現(xiàn)較少，且與年齡無關(guān)。正常情況下估算，人在20歲時LBs陽性的胰島β細(xì)胞比例可達(dá)97%，因此提示分化新生的胰島β細(xì)胞比例極少(不足3%)，大部分的胰島β細(xì)胞在20歲以前已經(jīng)形成并達(dá)到高峰，無證據(jù)表明20歲以后β細(xì)胞還有不斷新生和復(fù)制。不管是LBs含量還是LBs陽性細(xì)胞比例均與BMI或T2DM無關(guān)，提示成人胰島并非以細(xì)胞復(fù)制來應(yīng)對胰島素需求增加。因此認(rèn)為，β細(xì)胞的功能異常和凋亡，而非β再生能力下降是T2DM發(fā)病的關(guān)鍵因素[6,7]。綜上，正常人和T2DM患者的胰島β細(xì)胞增生都不活躍，早期即可發(fā)生的β細(xì)胞凋亡和功能異常是T2DM發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。

3.目前公認(rèn)的導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰退的原因有以下幾種：

3.1 脂毒性作用 Cnop等[8]研究顯示，人的胰島β細(xì)胞內(nèi)有富含LDL及vLDL的脂質(zhì)貯存顆粒(lipid-storing vesicles，LSVs)的聚集。隨著增齡，β細(xì)胞內(nèi)LSVs含量逐漸增加，這可能導(dǎo)致β細(xì)胞長期暴露于高脂環(huán)境下。β細(xì)胞內(nèi)FFA聚集可誘導(dǎo)NO合酶產(chǎn)生及NO介導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡；FFA增加線粒體的脂質(zhì)氧化，使線粒體ATP生成減少，代謝偶聯(lián)因子下降，并從而產(chǎn)生更多的活性氧(ROS)，誘導(dǎo)激活自噬溶酶體的酶解作用；FFA還通過誘導(dǎo)β細(xì)胞的ER應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，脂毒性促進(jìn)β細(xì)胞衰退，是導(dǎo)致T2DM發(fā)病的重要因素[9]。

3.2 葡萄糖毒性作用

研究表明，中、重度血糖增高可以降低機(jī)體葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌(glucose-induced insulin secretion，GIIS)，促進(jìn)IGT進(jìn)展為糖尿病。長期暴露于高糖條件下的大鼠胰島β細(xì)胞的表型發(fā)生改變[10]。事實上，長期暴露于高糖條件具有雙重作用，一些研究結(jié)果表明，β細(xì)胞的GIIS缺陷是由于高糖誘導(dǎo)下的ATP合成減少，稱之為“對葡萄糖的敏感性下降”；而另一些研究則顯示，β細(xì)胞暴露于高糖環(huán)境使其對高糖的敏感性增高，從而刺激線粒體代謝、胰島素原的合成及胰島素的分泌，這將引發(fā)在β細(xì)胞即使在低濃度葡萄糖時也存在ATP生成過多。因此在長時間暴露于高糖條件下時，雖然部分存活的β細(xì)胞仍存在對“葡萄糖的高敏感性”，但同時部分β細(xì)胞也已經(jīng)發(fā)生了凋亡[11]。此外，Bachar等[12]研究還發(fā)現(xiàn)，高糖通過增高IRE1α蛋白水平及激活JUN途徑，可以促進(jìn)FFA誘導(dǎo)的ER應(yīng)激，促進(jìn)β細(xì)胞功能紊亂及導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3.3 氧化應(yīng)激及線粒體途徑

研究表明，GIIS可增強(qiáng)線粒體ATP信號，從而增加胰島β細(xì)胞線粒體的代謝流，而高脂可以增強(qiáng)這個作用。高糖、高脂通過呼吸鏈增加線粒體代謝流，進(jìn)而增加活性氧(ROS)的生成；另一方面，隨之通過解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的作用降低線粒體膜的電壓，從而降低呼吸鏈的代謝流和活性氧的生成，發(fā)揮對ROS誘導(dǎo)損傷的保護(hù)性機(jī)制，但同時降低由代謝物質(zhì)誘導(dǎo)的胰島素的分泌[13]。β細(xì)胞由于缺乏抗氧化酶的表達(dá)，尤其易受到ROS攻擊；增高的ROS破壞GIIS，降低β細(xì)胞關(guān)鍵基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。此外，氧化應(yīng)激還觸發(fā)胰島素抵抗，從而在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用[15]。3.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激途徑

ER應(yīng)激是在細(xì)胞在高分泌活動時的重要適應(yīng)性細(xì)胞信號反應(yīng)，又稱非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。這種細(xì)胞反應(yīng)的目的是通過降低蛋白質(zhì)翻譯，上調(diào)ER的分子伴侶(因此增加ER折疊能力)以及降解錯誤折疊的蛋白從而恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài)[16]。當(dāng)錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)引發(fā)ER應(yīng)激時，導(dǎo)致ER膜蛋白IRE1、ATF6及PERK活化，這些ER應(yīng)激轉(zhuǎn)換蛋白與ER分子伴侶(BiP)解離而激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[17](見圖1)。

圖1 ER應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[17]

胰島β細(xì)胞大量合成胰島素(占所有合成蛋白質(zhì)的50%以上)，并高水平表達(dá)ER應(yīng)激的轉(zhuǎn)換蛋白IRE1和PERK。臨床中可以看到，PERK的基因(EIF2AK3)突變可導(dǎo)致新生兒及嬰兒糖尿病(Wolscott-Rallison綜合征)[18]；編碼ER Ca2+通道的WFS1基因突變導(dǎo)致Wolfram綜合征伴糖尿病[19]；而特異性針對β細(xì)胞的胰島素基因突變也可導(dǎo)致新生兒糖尿病[20,21]，這些突變可能是引起胰島素的錯誤折疊從而引發(fā)ER應(yīng)激，進(jìn)而破壞胰島細(xì)胞功能，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡和數(shù)量減少；動物研究顯示，攜帶Ins2基因錯義突變 (Cys96Tyr)的Akita小鼠自發(fā)出現(xiàn)高血糖和β細(xì)胞數(shù)量減少，而無胰腺炎和肥胖。在Akita小鼠發(fā)生糖尿病的過程中，ER分子伴侶BiP的mRNA表達(dá)增高，并誘導(dǎo)胰腺中ER應(yīng)激相關(guān)凋亡因子CHOP的表達(dá)增加。體外試驗中，小鼠MIN6 β細(xì)胞過表達(dá)突變的胰島素insulin 2C96Y也誘導(dǎo)CHOP表達(dá)并導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡；而破壞CHOP基因的表達(dá)可延緩雜合子Akita小鼠(Ins2WT/C96Y)糖尿病發(fā)病達(dá)8～10周[22]。

越來越多的研究表明，T2DM患者的胰島β細(xì)胞存在ER應(yīng)激，例如，T2DM患者的胰腺組織切片顯示ER應(yīng)激的標(biāo)志物表達(dá)增高[23]；T2DM患者β細(xì)胞的ATF3表達(dá)增高，eIF2α的下游蛋白ATF4[24]和CHOP[25]表達(dá)也增高。

研究發(fā)現(xiàn)[26]，在INS-1細(xì)胞，棕櫚酸和油酸誘導(dǎo)CHOP、ATF-4、BiP、XBP-1，激活A(yù)TF-6 啟動子，提示這種FFA引發(fā)的ER應(yīng)激反應(yīng)可能在脂毒性所導(dǎo)致的β細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示[27,28]，飽和脂肪酸所誘導(dǎo)的ER應(yīng)激是重要的T2DM發(fā)生機(jī)制，棕櫚酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡主要是通過PERK依賴的CHOP途徑介導(dǎo)的。

棕櫚酸誘導(dǎo)的ER應(yīng)激，分別經(jīng)PERK-CHOP途徑，通過抑制Bcl-2，誘導(dǎo)Caspase 3的表達(dá)而引發(fā)細(xì)胞凋亡；經(jīng)IRE1途徑，通過募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(TRAF2)，激活下游JUN途徑進(jìn)而促進(jìn)凋亡發(fā)生；此外，IRE1還可直接激活Caspase 12，引發(fā)β細(xì)胞凋亡[29]。

此外，ER應(yīng)激還與高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟及脂肪組織的胰島素抵抗有關(guān)[30]；在肥胖者的脂肪和肝臟組織中也檢測到ER應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)增高[31,32]。因此，ER應(yīng)激可能是T2DM兩大病理生理紊亂，包括胰島素抵抗和β細(xì)胞功能衰退的共同機(jī)制[33]。

利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞功能

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動劑是一類新的具有多種效應(yīng)的抗糖尿病藥物，這類藥物通過刺激胰島素分泌，抑制胰高糖素分泌等發(fā)揮降糖療效。近年來人GLP-1類似物利拉魯肽(Liraglutide)的相關(guān)研究顯示，其減少β細(xì)胞凋亡的相關(guān)證據(jù)越來越多。

Friedreich共濟(jì)失調(diào)(FRDA)是一種少見的由于Frataxin基因突變而致其功能喪失，從而導(dǎo)致呼吸鏈功能障礙而引發(fā)的一種神經(jīng)變性疾病。該病可合并糖尿病(約占10%～30%)，但機(jī)制不清。Cnop等[34]通過對41例FRDA患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者的葡萄糖處置指數(shù)顯著降低，提示存在胰島β細(xì)胞功能失調(diào)；對部分病例的尸檢胰腺病理切片分析，還發(fā)現(xiàn)FRDA患者胰島中的β細(xì)胞數(shù)量減少。這一結(jié)論在Frataxin敲除的大鼠β細(xì)胞研究中也得到證實，F(xiàn)rataxin敲除的大鼠β細(xì)胞及人胰島均有葡萄糖刺激的胰島素分泌減少及β細(xì)胞凋亡，這可能與Frataxin缺乏使β細(xì)胞對油酸及ER應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡更加敏感有關(guān)。而GLP-1和葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽(GIP)可以保護(hù)保護(hù)Frataxin缺失的β細(xì)胞免于凋亡。

利拉魯肽的體外研究[35]，在高糖(25mmol/L)或正常糖(5mmol/L)條件下，分別加入利拉魯肽或3-methyadenine分別孵育INS-1細(xì)胞24小時后檢測細(xì)胞活力、自噬作用的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，高糖處理后INS-1細(xì)胞活力降低；自噬作用被抑制，INS-1細(xì)胞活力下降，凋亡也增加；而同時在高糖條件下加入利拉魯肽INS-1細(xì)胞活力較單獨高糖處理時有顯著增加。因此認(rèn)為利拉魯肽可以保護(hù)INS-1細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的凋亡以及與之相伴隨的顯著增加的自噬作用的影響。

用原代新生大鼠胰島進(jìn)行的體外研究顯示[36]，天然GLP-1和利拉魯肽可以通過劑量依賴的方式抑制細(xì)胞因子和FFA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡；并且這一抗凋亡效應(yīng)是通過GLP-1受體發(fā)揮作用的。在體的動物實驗[37]，在10周齡大的雄性db/db及m/m小鼠分別接受利拉魯肽或生理鹽水每日2次皮下注射共2周，比較治療前后胰島形態(tài)和生化、以及基因表達(dá)的改變情況。結(jié)果顯示，利拉魯肽改善db/db小鼠的代謝指標(biāo)和胰島素敏感性，其不僅增加葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)及胰島內(nèi)胰島素含量，降低胰島內(nèi)甘油三酯含量，還可下調(diào)促凋亡基因、ER應(yīng)激及脂質(zhì)合成的基因，上調(diào)細(xì)胞抗凋亡及抗氧化應(yīng)激的基因等。形態(tài)學(xué)上的分析包括胰島細(xì)胞的增殖、凋亡及氧化應(yīng)激結(jié)果與基因分析結(jié)果相一致。

糖尿病前期的動物試驗結(jié)果也顯示[38]，12周齡的OLEFT大鼠分別以利拉魯肽50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg劑量或生理鹽水每日2次皮下注射共計12周，測定體重、攝食量、血脂、炎癥標(biāo)志物(纖維蛋白原、高敏C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNFα、PAI-1)、血糖、胰島素敏感性及凋亡因子(Bcl-2和Bax)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)12周齡的OLETF大鼠有顯著的體重及攝食量增加，血脂水平升高，炎癥因子及胰島素水平增高。FPG水平顯著增高但不超過7.0mmol/L且無IGT。治療12周以后，對照組IFG、IGT、胰島素抵抗、血脂、炎癥狀態(tài)均進(jìn)一步惡化；胰島體積增大且結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤，而三組利拉魯肽治療組的IFG、IGT、增高的血脂及炎癥標(biāo)志物均得到逆轉(zhuǎn)；胰島素抵抗程度與治療前水平相當(dāng)；且利拉魯肽恢復(fù)胰島結(jié)構(gòu)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，提示利拉魯肽可能是通過調(diào)整凋亡因子及改善血脂代謝和炎癥狀態(tài)而恢復(fù)胰島功能，從而抑制糖尿病前期的OLETF大鼠向糖尿病演變。

總結(jié)

在T2DM發(fā)生發(fā)展過程中，胰島β細(xì)胞數(shù)量減少及β細(xì)胞功能紊亂是核心的致病因素，其中涉及各種不同的發(fā)生機(jī)制，其中近年來ER應(yīng)激研究進(jìn)展較快，并且ER應(yīng)激被認(rèn)為是β細(xì)胞功能衰退的重要原因之一。利拉魯肽具有抗ER應(yīng)激、促進(jìn)β細(xì)胞增殖、分化，抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等多重作用從而抑制β細(xì)胞的凋亡，能夠更好地保護(hù)胰島功能和保存胰島細(xì)胞數(shù)量，因此在T2DM治療中具有美好的前景。

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