花椒生物堿提取工藝及抗氧化、抑制酪氨酸酶活性研究

王 雅，趙春萌，謝 婕，趙 萍，馬建蘋(píng)，郭 濤

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

花椒為蕓香科植物，全世界約有250種[1]，我國(guó)約有45種[2]，可用作調(diào)味品，其果實(shí)、根、莖和葉均可入藥，有祛風(fēng)活絡(luò)、散瘀止痛、解毒消腫、抗菌消炎之功效[3-4]。生物堿是指天然的含氮有機(jī)化合物，但不包括開(kāi)鏈的簡(jiǎn)單脂肪胺。目前，花椒中發(fā)現(xiàn)的生物堿有茵芋堿、香草檸、青花椒堿等?；ń飞飰A具有多種生理功能如抑菌、抗腫瘤、抑制血小板凝集等[5]。

DPPH可以較好的評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力[6]。酪氨酸酶作為黑色素形成過(guò)程的關(guān)鍵酶，抑制它的活性可以抑制黑色素的形成[7]，抑制其活性可評(píng)估皮膚美白劑效果[8]。王如平等[9]對(duì)花椒中總生物堿提取條件進(jìn)行過(guò)研究，然而其并未對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。而其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用未見(jiàn)報(bào)道。本文探討了花椒生物堿的提取工藝及其抗氧化、酪氨酸酶抑制活性，以期為花椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒 2012年10月采自甘肅甘谷縣，經(jīng)鑒定為秦椒（Zanthoxylum bungeanum）；1，1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH）、蘑菇酪氨酸酶、L-酪氨酸、L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA） Sigma-Aldrich公司；茵芋堿標(biāo)準(zhǔn)品 阿生納。

Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司；PHS-3D pH計(jì) 上海精密儀器制造有限公司；JY92-Ⅱ數(shù)控超聲波粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茵芋堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 生物堿含量測(cè)定采用酸性染料比色法[9]。稱(chēng)取5mg茵芋堿于25mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇，超聲溶解定容，得到0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1、2、3、4、5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于20mL比色管中，加無(wú)水乙醇補(bǔ)至5mL，依次加入溴甲酚綠2mL和10mL氯仿溶液，用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH到4.5，振搖2min后，倒入分液漏斗中靜置1h后，取氯仿層，掃描最大吸收波長(zhǎng)，以未加茵芋堿的氯仿萃取液為隨行空白。在此波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以茵芋堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=3.9374x+0.0031，R2=0.9975。

1.2.2 花椒生物堿的提取及含量測(cè)定 花椒粉碎過(guò)40目篩，稱(chēng)取一定量的粉末，以一定濃度的乙醇作溶劑，在pH為3的條件下超聲輔助提取后，將其上清液按照1.2.1的方法測(cè)定吸光度，并據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算生物堿含量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。生物堿提取率=生物堿含量/花椒粉末質(zhì)量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別研究乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）、料液比、超聲時(shí)間及超聲功率對(duì)花椒生物堿提取效果的影響。以料液比1∶20g/mL，超聲功率200W，提取時(shí)間10min，研究乙醇濃度60%、70%、80%、90%、100%對(duì)花椒生物堿提取率的影響。以所得出的適宜的乙醇濃度，超聲功率200W，提取時(shí)間10min，考察料液比1∶14、1∶16、1∶18、1∶20g/mL對(duì)花椒生物堿提取率的影響。以所得出的適宜的料液比及乙醇濃度，超聲功率200W，研究不同提取時(shí)間5、10、15、20min對(duì)生物堿提取率的影響。固定以上單因素實(shí)驗(yàn)所得適宜的料液比，乙醇濃度，超聲時(shí)間，考察超聲功率100、200、300、400W對(duì)生物堿提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。以花椒生物堿提取率作為響應(yīng)值，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇實(shí)驗(yàn)因素及水平，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 花椒生物堿制備 將1.2.4響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)提取工藝條件下提取的生物堿粗提物，進(jìn)行純化處理[10]，以測(cè)定其抗氧化及酪氨酸酶抑制活性。將提取液進(jìn)行減壓濃縮，至粘稠。加入2%的鹽酸水溶解，過(guò)濾。取酸水層用25%的濃氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，并用氯仿萃取。將萃取液進(jìn)行減壓濃縮，得花椒總生物堿，備用。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定方法參考Aruomaoi[11]和Sánchez-Moreno C[12]并略有改進(jìn)。將DPPH配制成濃度為0.025mg/mL的溶液。精確吸取DPPH溶液2mL，與2mL80%乙醇溶液混合，以80%乙醇為對(duì)照，測(cè)定溶液在517nm處的吸光度值（A0）；精確移取不同濃度的樣液2mL，分別與DPPH溶液2mL混合，搖勻后放置30min。以80%乙醇為對(duì)照，測(cè)定上述溶液在517nm處的吸光度值（Ai）；精確吸取上述不同濃度的樣液2mL，分別與2mL 80%乙醇混合均勻，以80%乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517nm處的吸光度值（Aj）。

計(jì)算其清除率（SR），得到清除率在一定濃度范圍的回歸方程，通過(guò)線(xiàn)性方程計(jì)算IC50，即DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣液濃度。IC50值越小，樣品清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.7 酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定 酪氨酸酶活性測(cè)定參考N Baurin[13]的方法并稍作修改。將100μL的0.5mmol/L的L-DOPA溶液，100μL的10mmol/的L-酪氨酸，3500μL的50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）以及200μL試樣混合。然后，加入50μL的蘑菇酪氨酸酶（1600U/mL）。37℃保溫10min后，由于形成多巴色素，使得在475nm時(shí)有最大吸收，從而可使用分光光度計(jì)來(lái)監(jiān)測(cè)。酪氨酸活性抑制百分?jǐn)?shù)可用如下公式計(jì)算：

式中，A為試樣在475nm的吸光值；B為試樣，不加酶在475nm下的吸光值；A0為空白對(duì)照在475nm的吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理均采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0.6。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)生物堿提取率的影響 由圖1可知，生物堿的提取率隨乙醇濃度的升高而增大。乙醇濃度為80%時(shí)提取率最高，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)上升時(shí)生物堿提取率開(kāi)始有所下降。有資料顯示，乙醇與水以一定比例混合可增加生物堿的溶解度，當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，提取液中水分含量就會(huì)相對(duì)下降，從而導(dǎo)致花椒中的生物堿不能充分的溶解在提取液中，最終導(dǎo)致生物堿提取率有所下降。因此，最優(yōu)乙醇濃度條件選擇80%。

圖1 乙醇濃度對(duì)生物堿提取率的影響Fig.1 The effect of the ethanol concentration on the yield of alkaloid

2.1.2 料液比對(duì)生物堿提取率的影響 由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，生物堿提取率隨料液比的增大而增大。當(dāng)料液比為1∶20g/mL時(shí)提取率最高。花椒生物堿提取屬于固液萃取，濃度差是該過(guò)程的推動(dòng)力[14]。溶劑用量越大，生物堿在物料和溶劑之間的濃度差越大，對(duì)提高傳質(zhì)速率和降低殘?jiān)械纳飰A含量越有利，但溶劑用量過(guò)大，造成溶劑回收困難。由圖4可以看出，當(dāng)料液比大于1∶16g/mL時(shí)，花椒生物堿提取率基本不變，達(dá)到最大提取率，故確定最佳料液比為1∶16g/mL。

圖2 料液比對(duì)生物堿提取率的影響Fig.2 The effect of the liquid ratio on the yield of alkaloid

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響 由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，生物堿的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增大。超聲時(shí)間為10min時(shí)提取率最高，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)生物堿提取率開(kāi)始有所下降。這可能是因?yàn)樵谔崛〉某暡ㄕ袷庍^(guò)程中，提取液中會(huì)進(jìn)入大量空氣，導(dǎo)致與氧氣充分接觸生物堿結(jié)構(gòu)被破壞，從而使提取率有所下降。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響Fig.3 The effect of the ultrasound time on the yield of alkaloid

2.1.4 超聲功率對(duì)生物堿提取率的影響 由圖4可知，超聲功率為200W時(shí)提取率最高，當(dāng)超聲功率繼續(xù)上升時(shí)生物堿的提取率下降。超聲功率過(guò)低會(huì)造成生物堿提取不完全從而降低提取工藝的效率。若超聲功率過(guò)高，生物堿結(jié)構(gòu)被破壞，降低其含量。因此，最佳超聲功率為200W。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 超聲功率對(duì)生物堿提取率的影響Fig.4 The effects of the ultrasonic power on the yield of alkaloid

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The design and results of the response surface design

運(yùn)用Design Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，擬合后得到的超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：花椒生物堿提取率Y（%）=-13.43+0.0074A+0.14B+0.62C+0.20D+0.000040AB+0.00041AC-0.00013AD+0.00075BC-0.000050BD-0.0016CD-0.000010A2-0.0071B2-0.018C2-0.00067D2。對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of regression model

該回歸模型其回歸系數(shù)R2＝0.9436，R2Adj＝0.8873，表明此模型能較好地反映花椒生物堿提取率與超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、乙醇濃度的關(guān)系，可見(jiàn)這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。

由結(jié)果得知，AB對(duì)響應(yīng)值花椒生物堿提取率影響極顯著，CD對(duì)響應(yīng)值花椒生物堿提取率的影響顯著。經(jīng)F檢驗(yàn)顯示總模型方程顯著（p＜0.0001）。

根據(jù)表3中F值的大小可以判斷各因素對(duì)花椒生物堿提取率影響的強(qiáng)弱。F值越大，影響作用越強(qiáng)。因此各因素對(duì)花椒生物堿提取影響程度由大到小依次為：超聲時(shí)間（B）＞超聲功率（A）＞乙醇濃度（D）＞料液比（C）。

圖5 超聲功率（A）與料液比（C）交互作用對(duì)生物堿提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of mutual-action for ultrasonic power and liquid ratio on the yield of alkaloid

超聲功率（A）與料液比（C）因素間交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。如圖5所示，在較小的范圍內(nèi)隨著超聲功率的增大，響應(yīng)值增大較明顯。但是料液比的增大對(duì)響應(yīng)值的影響較弱，因此超聲功率是主要影響因素。從響應(yīng)面圖中還可以得出，隨著超聲功率和料液比的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著各因素值的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

圖6 超聲功率（A）與乙醇濃度（D）的交互作用對(duì)花椒生物堿提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of mutual-action for ultrasonic power and the ethanol concentration on the yield of alkaloid

超聲功率（A）與乙醇濃度（D）的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。如圖6所示，在起始的范圍內(nèi)，隨超聲功率的增大，響應(yīng)值增大明顯；隨著超聲功率繼續(xù)增加，響應(yīng)值增大不明顯。隨乙醇濃度的增大，響應(yīng)值增大明顯。

通過(guò)軟件Design-Expert求解回歸方程，得到花椒生物堿最佳提取工藝條件為超聲功率233.47W，超聲時(shí)間10.96min，料液比1∶16.26g/mL，乙醇濃度79.19%，花椒生物堿提取率可達(dá)到1.20%。

2.3 模型驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，同時(shí)考慮到實(shí)際操作和實(shí)驗(yàn)儀器的局限性，修正后的最佳工藝條件如下：超聲功率233W，超聲時(shí)間11min，料液比1∶16g/mL，乙醇濃度79%。在此條件下進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，花椒生物堿的平均提取率為1.19%，與理論值吻合較好，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 生物堿的抗氧化活性結(jié)果

表4 花椒生物堿與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力比較Table 4 The comparison of the alkaloid and VCon DPPH scavenging activities

由圖7可知，花椒生物堿對(duì)DPPH自由基有明顯的清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。由表4中花椒生物堿的IC50值大于VC的IC50。說(shuō)明花椒生物堿對(duì)DPPH自由基清除的能力相對(duì)弱于VC。

2.5 生物堿對(duì)酪氨酸酶的抑制效果

圖7 花椒生物堿及VC對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 The DPPH·scavenging activities of alkaloid and VC

圖8 花椒生物堿及VC對(duì)酪氨酸酶的抑制活性Fig.8 The tyrosianse inhibition activities of alkaloid and VC

表5 花椒生物堿及VC對(duì)酪氨酸酶的抑制活性比較Table 5 The comparison of the alkaloid and VCon tyrosinase inhibition activities

如圖8所示，花椒生物堿有一定的抑制酪氨酸酶活性的能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，花椒生物堿和陽(yáng)性對(duì)照VC隨濃度的增大，其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果不斷增加。由表5可知，花椒生物堿抑制酪氨酸酶活性的IC50值大于VC的IC50值，說(shuō)明花椒生物堿抑制酪氨酸酶活性的能力弱于VC。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化，確定了超聲波輔助提取花椒生物堿的最佳提取工藝條件，即超聲功率233W，超聲時(shí)間11min，料液比1∶16g/mL，乙醇濃度79%，此時(shí)花椒生物堿提取率可達(dá)到1.19%。在各影響因素中，超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率影響最大，而料液比的影響最小。對(duì)最優(yōu)提取條件下提取的花椒生物堿進(jìn)行抗氧化和抑制酪氨酸酶的活性研究表明：花椒生物堿有一定的清除DPPH自由基及抑制酪氨酸酶活性的能力，但此兩種活性均弱于VC。

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