基質(zhì)金屬蛋白酶-8在急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層中的表達(dá)及臨床意義

王 巒，嚴(yán)中亞，章慶春，宋曉蓉

急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層是一種病情兇險(xiǎn)、病死率極高的心血管疾病。隨著生活水平提升及檢測(cè)手段的增加，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚［1］?；|(zhì)金屬酶是一個(gè)Zn2+依賴性，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解代謝的酶家族。其在血管重塑過程中發(fā)揮重要作用［2］。研究［3］表明，在主動(dòng)脈夾層中金屬蛋白酶家族許多成員表達(dá)升高，而關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)在主動(dòng)脈夾層中的相關(guān)表達(dá)報(bào)道較少。該研究分析MMP-8在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血漿及主動(dòng)脈壁中層的表達(dá)，初步探討其在急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2011年8月～2013年6月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院心臟外科Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者30例為實(shí)驗(yàn)組，其中男18例，女12例，年齡34～67(49.7±11.2)歲。選取同期住院單純主動(dòng)脈瓣病變患者30例為對(duì)照組，男16例，女14例，年齡35～74(49±11.1)歲?；颊呓?jīng)主動(dòng)脈CTA、超聲心動(dòng)、冠脈造影檢查確診。入選患者標(biāo)準(zhǔn):排除胸部損傷感染、炎癥、主動(dòng)脈瓣二葉畸形、馬凡綜合征、冠心病、升主動(dòng)脈內(nèi)徑＞40 mm。以上研究對(duì)象在年齡、性別方面等均匹配，具有可比性。術(shù)前所有患者均簽署知情同意書，并報(bào)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司;兔抗人MMP-8多克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司;通用型二抗PV6000工作液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;β-actin抗體和兔抗人MMP-8單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ELISA法檢測(cè)血漿中MMP-8的含量 采集患者入院首次空腹靜脈血，所有血液樣本均4℃、4 000 r/min離心20 min分離血清，－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。所有樣本按ELISA試劑盒說明書提供的方法檢測(cè)血清中MMP-8的含量。

1.2.2 HE染色 Stanford A型主動(dòng)脈夾層手術(shù)標(biāo)本取材方法:經(jīng)右腋動(dòng)脈聯(lián)合右心房上下腔靜脈建立體外循環(huán)。術(shù)中可見升主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂，升主動(dòng)脈壁二層分離。根據(jù)主動(dòng)脈瓣瓣葉受累及程度行單純升主動(dòng)脈置換(或Bentall術(shù)或David術(shù))聯(lián)合單分支覆膜支架置入術(shù)。取材位置距主動(dòng)脈瓣瓣環(huán)約3 cm處，取材包括與主動(dòng)脈壁撕裂部位相延續(xù)的2 cm正常血管壁組織。對(duì)照組取材相應(yīng)部位的血管壁全層組織。手術(shù)標(biāo)本取下后立即放入4%甲醛溶液中固定24 h后，沖洗、脫水、浸蠟、包埋，以4 μm厚度連續(xù)切片備用。HE染色:觀察對(duì)照組主動(dòng)脈壁的組織學(xué)形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈壁的病理改變。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈及正

常主動(dòng)脈血管組織中MMP-8表達(dá)水平 取約5 g凍存升主動(dòng)脈組織冰上裂解后煮沸5 min，于4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。上樣，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下TBS洗膜5 min，膜置于含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，TBS-T洗3次(5 min/次)。加入一抗(1∶500)4℃過夜，取出膜在TBS-T洗3次(5 min/次)，加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶1 000)，室溫下振蕩孵育1 h，室溫下TBS-T洗3次(5 min/次)，TBS洗1次，增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑顯色曝光。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)MMP-8的表達(dá) 采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。烘片后脫蠟，PBS洗滌，滅除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液。滴加一抗4℃過夜，PBS洗滌后加入二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片、烤片、顯微鏡拍照。使用Nikon80i熒光顯微鏡及圖像采集軟件進(jìn)行圖像采集分析。400倍顯微視野下分別選取10個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞占整個(gè)視野細(xì)胞百分比。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［4］:0～5%為陰性(－)，6% ～25%為弱陽性(+)，26% ～50%為陽性()，＞50%為強(qiáng)陽性()。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，定量變量組間差異采用t檢驗(yàn)，定性變量組間差異采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿中MMP-8的含量 實(shí)驗(yàn)組患者血漿中MMP-8的表達(dá)［(106.51±28.27)ng/ml］明顯高于對(duì)照組［(25.65±12.95)ng/ml］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 升主動(dòng)脈組織HE染色 實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈壁彈性纖維與膠原纖維層變性，排列雜亂無序，并伴有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤。而對(duì)照組主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，彈性纖維與膠原纖維排列緊密有序。見圖1。

圖1 升主動(dòng)脈壁HE染色 ×40

2.3 MMP-8的蛋白表達(dá)

2.3.1 Western blot法檢測(cè) Western blot結(jié)果顯示，MMP-8在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組患者血管組織中均有表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組患者升主動(dòng)脈中MMP-8(灰度相對(duì)值1.04±0.11)水平明顯高于對(duì)照組(灰度相對(duì)值0.60±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 MMP-8在升主動(dòng)脈中的表達(dá)

2.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 免疫組化陽性表達(dá)為細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色顆粒樣或片狀陰影。30例主動(dòng)脈夾層中有24例MMP-8陽性表達(dá)，陽性率80%，其中強(qiáng)陽性表達(dá)4例。病變?cè)趶椓w維與膠原纖維變性、排列紊亂的升主動(dòng)脈壁中層，MMP-8高表達(dá)，可見大量棕黃色物質(zhì)呈片狀分布，而在殘余的正常組織內(nèi)MMP-8低表達(dá)。對(duì)照組30例中4例陽性表達(dá)，陽性率13.3%，且陽性表達(dá)為弱陽性。升主動(dòng)脈壁中層彈力纖維與膠原纖維排列整齊有序，MMP-8低表達(dá)或不表達(dá)，僅散在染色點(diǎn)。見圖3。兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 MMP-8在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組主動(dòng)脈壁中的表達(dá)(例，n=30)

3 討論

目前研究［5］顯示血流動(dòng)力學(xué)因素與主動(dòng)脈壁薄弱因素共同作用導(dǎo)致夾層的發(fā)生。升主動(dòng)脈壁中層在維持主動(dòng)脈力學(xué)結(jié)構(gòu)中最重要，其完整性依賴于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡。升主動(dòng)脈中層ECM主要由膠原纖維與彈性纖維組成，彈性纖維維持血管的擴(kuò)張與收縮，膠原纖維韌性大，抗拉力強(qiáng)，起維持血管張力作用［6］。研究［7］顯示彈性蛋白酶的減少是引起主動(dòng)脈瘤形成的重要原因，而膠原蛋白酶的減少引起主動(dòng)脈的破裂。報(bào)道［8］表明主動(dòng)脈壁病理改變與主動(dòng)脈機(jī)械性能改變的主因是ECM的改變，而MMPs是降解ECM最主要的酶，MMP-8屬膠原酶，能裂解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型間質(zhì)膠原蛋白的天然螺旋結(jié)構(gòu)，參與并促進(jìn)主動(dòng)脈中層膠原蛋白與彈性蛋白的降解。本研究表明，主動(dòng)脈夾層患者升主動(dòng)脈壁中層彈性纖維與膠原纖維稀疏斷裂，雜亂無序，病變區(qū)MMP-8高表達(dá)。推測(cè)其可能在升主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本研究中急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者組織切片中，24例為陽性表達(dá)，陽性率80%，其中陽性15例，強(qiáng)陽性4例。而30例對(duì)照組組織切片中，4例為陽性表達(dá)，陽性率13.3%，且表達(dá)為弱陽性。實(shí)驗(yàn)組免疫組化顯示，MMP-8的強(qiáng)陽性表達(dá)主要集中于主動(dòng)脈壁中膜，夾層撕裂邊緣。主動(dòng)脈壁中Ⅰ型膠原蛋白的含量遠(yuǎn)高于其他型，且MMP-8降解Ⅰ型膠原蛋白的能力是最強(qiáng)的［9］。各種病理因素作用下MMP-8表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，導(dǎo)致主動(dòng)脈壁中層膠原纖維與彈性纖維降解增加，使主動(dòng)脈壁纖維網(wǎng)絡(luò)受損，抗張力下降，主動(dòng)脈發(fā)生中層退行性變或囊性壞死，升主動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)完整性受損，在高壓、高速的血流沖擊下，夾層發(fā)生易感性增加。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MMP-8在病變升主動(dòng)脈中膜層表達(dá)明顯升高，且其高表達(dá)處膠原纖維與彈性纖維破壞嚴(yán)重，雜亂無序。由此推測(cè)MMP-8的含量升高與升主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的破壞存在相關(guān)性。Rahkonen et al［10］認(rèn)為摘除小鼠調(diào)控Ⅰ型膠原纖維生長的Collal基因，小鼠主動(dòng)脈夾層的發(fā)生率上升。也與本研究觀點(diǎn)一致。MMP-8不僅作用于ECM還可以通過活化MMP-2、MMP-3及MMP-9等其他蛋白，加速ECM的降解［11］。而對(duì)照組中MMP-8不表達(dá)或僅有少量表達(dá)，則反映生理狀態(tài)下，MMP/TIMPs(金屬蛋白酶組織抑制因子)存在平衡。本實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組患者血清中MMP-8水平明顯高于對(duì)照組。MMP-8在主動(dòng)脈患者血漿中表達(dá)增高，其也可以作為急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層診斷的一個(gè)指標(biāo)因子。

綜上所述，主動(dòng)脈夾層患者血清及主動(dòng)脈壁中MMP-8的表達(dá)升高，此種改變直接影響ECM的結(jié)構(gòu)改變。因此推測(cè)MMP-8可作為急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層診斷的一個(gè)指標(biāo)，而MMP-8特異性抑制劑可能有助于修復(fù)或保持升主動(dòng)脈中層結(jié)構(gòu)完整性，對(duì)于升主動(dòng)脈增寬的患者，可預(yù)防主動(dòng)脈病或夾層的形成，具有一定的臨床意義。

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