T細(xì)胞亞群與慢性丙型肝炎病毒相關(guān)性分析

殷先堯，鄭美娟，徐元宏

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是全球范圍的重要公共衛(wèi)生問題之一，全世界約2億人口感染丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)，其中54%～86%的感染者6個月內(nèi)出現(xiàn)感染慢性化，形成持續(xù)性感染。我國是該病的高發(fā)地區(qū)，感染率約為3.2%［1］?；颊卟〕套兓cT淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和功能的相關(guān)性，已被多項研究證明可能是致病及慢性化因素［2］。CHC慢性化的機制，尤其是宿主的免疫因素引起的免疫反應(yīng)已成為研究的熱點之一。該研究對患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清中HCV RNA復(fù)制載量水平進行檢測，并對其之間相互關(guān)系進行了分析，以了解CHC患者機體的免疫功能紊亂情況，旨在對CHC發(fā)病機制及其防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2012年10月～2013年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院的69例CHC患者，其中男23例，女46例，年齡17～67(45.8±13.8)歲，診斷均符合2011年《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性疾病、酒精性肝病、肝硬化、腫瘤、代謝性疾病及嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，實驗檢查前6個月均無抗病毒和免疫調(diào)節(jié)藥物治療。按照不同的HCV RNA載量水平分為高載量組、中載量組、低載量組作為實驗組，其中高載量組的HCV RNA載量為＞1.00×105copies/ml;中載量組的HCV RNA載量為1.00×103～1.00×105copies/ml;低載量組的 HCV RNA載量為＜1.00×103copies/ml。另選年齡和性別匹配的健康體檢者20例作為正常對照組，年齡36～59(44.6±6.6)歲。實驗組及正常對照組肝腎功能各項指標(biāo)處于正常范圍。

1.2 儀器和試劑 COULTER Epics XL MCL流式細(xì)胞儀為美國BECKMAN COULTER公司;CD3/CD4/CD8熒光標(biāo)記單克隆抗體及紅細(xì)胞裂解液為Opti-Clone原裝配套試劑;PCR擴增儀為瑞士Roche公司的Light-Cycler熒光定量核酸擴增儀;HCV核酸定量試劑盒為上海科華生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 HCV RNA載量檢測 采用實時熒光定量PCR法，嚴(yán)格按照試劑說明書步驟進行，HCV RNA檢測單位用copies/ml表示。

1.3.2 T細(xì)胞亞群檢測 取CHC患者及正常健康者外周靜脈血1 ml，EDTA-K2抗凝。于干凈試管中加入20 μl三標(biāo)記單克隆抗體CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5，再加入100 μl抗凝靜脈血，充分混勻，25℃避光孵育15 min，加入紅細(xì)胞溶解液250 μl，充分溶解紅細(xì)胞20 min后，以1 200 r/min的速度離心5 min，去上清液，PBS緩沖液沖洗2次，最后以500 μl的PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測10 000個淋巴細(xì)胞，各細(xì)胞亞群用百分比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗分析。多組間兩兩比較用方差檢驗分析，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布 CHC患者外周血T細(xì)胞亞群與正常健康者之間關(guān)系見表1。CHC患者外周血T細(xì)胞亞群的流式散點圖見圖1。

表1 CHC患者和正常健康者T細(xì)胞亞群分布(±s)

表1 CHC患者和正常健康者T細(xì)胞亞群分布(±s)

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圖1 CHC患者CD4+、CD8+細(xì)胞流式散點圖

2.2CHC患者HCV RNA載量與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 從表2可看出各組之間比較，通過Spearman等級相關(guān)分析得知，CD3+T細(xì)胞百分率與 HCV RNA載量無相關(guān)性(r=0.068，P=0.576);CD4+T細(xì)胞百分率、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值均與 HCV RNA載量相關(guān)(r=0.477，P ＜0.01;r=0.599，P ＜0.01;r=0.896，P ＜0.01)。即隨著HCV RNA載量的增加，CD8+T細(xì)胞百分率逐漸增加，而 CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值逐漸降低，見圖2。

表2 不同HCV RNA載量CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布(±s)

表2 不同HCV RNA載量CHC患者外周血T細(xì)胞亞群分布(±s)

與高載量組比較:＊＊P＜0.01;與中載量組比較:＆P＜0.05，＆＆P＜0.01;與正常對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

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圖2 HCV RNA載量與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析

3 討論

研究［4－5］顯示細(xì)胞免疫應(yīng)答對CHC患者病情發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起主要作用，淋巴細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞也是機體免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，其數(shù)量的變化在一定程度上反映了機體的免疫水平。當(dāng)HCV侵犯肝臟時，由于肝臟及機體本身有極強的代償能力，導(dǎo)致臨床上往往并不體現(xiàn)為血清生化指標(biāo)的上升，而免疫功能紊亂才是造成肝損傷的重要因素［6］。外周血T淋巴細(xì)胞各亞群水平間的相對穩(wěn)定是機體發(fā)揮正常免疫功能的重要基礎(chǔ)。T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和各亞群比例是反映機體免疫水平的主要標(biāo)志，CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞除在免疫應(yīng)答中起輔助、誘導(dǎo)作用外，還可分泌淋巴因子，啟動遲發(fā)性超敏反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，引起肝細(xì)胞損傷的效應(yīng)［5］;CD4+T細(xì)胞還能促進B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的增殖及分化，調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫。CD8+T細(xì)胞由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和少許抑制性T細(xì)胞組成，正常情況下，兩者保持一定的比例，維持機體的細(xì)胞免疫功能。

本研究顯示，CHC患者CD8+比例高于正常健康者，而CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值均低于正常健康者，CD3+T細(xì)胞與正常健康者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與國內(nèi)學(xué)者的報道［7－8］一致。HCV感染后引起外周血T細(xì)胞亞群的這種變化可能是CHC慢性化的重要原因之一，迄今為止，HCV的致病機制仍不明確，細(xì)胞免疫可能是HCV發(fā)病的主要機制，CHC患者在抗原提呈細(xì)胞的作用下HCV致敏的CD8+T細(xì)胞攻擊肝細(xì)胞從而導(dǎo)致自身肝細(xì)胞的溶解。最近，研究［9］顯示HCV特異性CD8+T細(xì)胞上存在多種抑制性受體的表達。具有抗原特異性的CD4+T細(xì)胞在清除HCV及致病過程中發(fā)揮著重要作用。兩者比例發(fā)生變化后有可能導(dǎo)致兩種細(xì)胞不能很好地協(xié)調(diào)作用，從而影響了機體清除HCV的能力，導(dǎo)致感染的持續(xù)［10］。CD4+T細(xì)胞在激發(fā)抗原提呈細(xì)胞活性及誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。強而持久的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)能增強機體清除病毒的能力。在HCV感染黑猩猩的動物試驗中發(fā)現(xiàn)，即使在CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)正常的情況下，CD4+T細(xì)胞的消耗也將導(dǎo)致HCV感染慢性化［11－13］。有學(xué)者［14］認(rèn)為，CD4+、CD8+T 細(xì)胞的相互協(xié)調(diào)能有效控制病毒感染，有效控制HCV感染需要一個持久、廣泛的輔助和細(xì)胞毒細(xì)胞反應(yīng)，如果患者不能產(chǎn)生或不能維持持久的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，通常不能有效清除病毒，導(dǎo)致感染慢性化。

血清HCV RNA含量反映了病毒復(fù)制的活躍程度和病情變化，從基因診斷角度直接反映了血清HCV存在的情況，也是反映CHC傳染性的指標(biāo)。血清中的HCV RNA載量與肝組織HCV RNA呈正相關(guān)［15］。血清HCV RNA的檢測能直接反映CHC的病毒血癥水平。同時檢測了CHC患者血清中HCV RNA的載量，研究病毒復(fù)制程度與細(xì)胞免疫功能的關(guān)系。結(jié)果表明隨著病毒拷貝數(shù)的增加，CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值明顯減少;CD8+T細(xì)胞百分率則與HCV RNA拷貝數(shù)的增加成正比。說明免疫功能紊亂，導(dǎo)致循環(huán)病毒量增加，免疫應(yīng)答低下使機體難以清除病毒。檢測顯示，HCV RNA陰性組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率與中載量組和高載量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與正常健康者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但其CD4+/CD8+比值卻明顯低于正常對照組。說明HCV感染后，機體免疫功能的改變首先反映在CD4+/CD8+比值下降，推斷該值的持續(xù)下降與HCV持續(xù)存在和復(fù)制水平有關(guān)。

綜上所述，CHC患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例改變，可能是導(dǎo)致HCV感染慢性化的重要原因之一。HCV RNA復(fù)制增加進一步加重CHC患者外周血T細(xì)胞亞群的紊亂，CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化可及時提示臨床HCV感染者細(xì)胞免疫功能的變化并加強臨床的預(yù)測。因此聯(lián)合檢測血清HCV RNA和外周血T淋巴細(xì)胞亞群對觀察CHC患者的病毒復(fù)制程度及判斷細(xì)胞免疫功能具有一定的臨床價值。

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