TOLL樣受體4對脂多糖致急性肺損傷大鼠炎癥因子的影響

黃繼義，劉才文，林建東，葉先龍，洪朝基，周 榮

TOLL樣受體4對脂多糖致急性肺損傷大鼠炎癥因子的影響

黃繼義，劉才文，林建東，葉先龍，洪朝基，周 榮

目的 探討TOLL樣受體4(TLR-4)表達對脂多糖誘導急性肺損傷(ALI)大鼠體內炎癥因子的影響，明確阻斷TLR-4表達對急性肺損傷的保護作用。方法 45只雄性Wistar大鼠隨機分為：正常對照組、ALI組和干預組，每組15只。ALI組和干預組采用靜脈注射脂多糖(LPS)方法構建急性肺損傷模型，對照組注射等量的生理鹽水。各組動物再按照觀察時間點平均分為造模后6、12和24 h各3個亞組。測定各組肺組織TLR-4 mRNA表達以及支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度，觀察各組大鼠肺組織的病理變化。結果 LPS可以導致肺泡腔內TNF-α、IL-1β和IL-6濃度增加，阻斷TLR-4受體會抑制炎癥因子釋放；ALI組的肺損傷評分高于干預組和正常對照組(3.3±1.1 vs.1.9±1.0 vs.1.2±0.9)。結論 阻斷TLR-4表達能抑制脂多糖誘導ALI大鼠體內炎癥因子分泌，減輕肺組織病理損害，能達到治療ALI的作用。

急性肺損傷；Toll樣受體4；炎癥因子

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是全身炎癥反應綜合征(SIRS)最早出現(xiàn)的器官損害，可進一步發(fā)展為急性呼吸衰竭。ALI病情兇險，治療困難，死亡率高，一直是臨床治療的棘手難題[1]。感染尤其是革蘭陰性菌膿毒癥是導致ALI的主要病因，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌外膜上的主要成分，LPS進入體內后，除本身對肺血管內皮的損傷作用外，可激活血小板、中性粒細胞、巨噬細胞以及補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等，促使內源性介質釋放和炎癥因子的過度分泌，造成肺組織的損傷，誘導實驗性ALI模型[2]。研究發(fā)現(xiàn)，TOLL樣受體4(TLR-4)炎癥通路在這一過程中起重要作用[3]。本研究擬探討TLR-4對脂多糖誘導ALI大鼠體內炎癥因子表達的影響，闡明TLR-4拮抗劑對ALI的保護作用，為臨床治療和新藥研發(fā)提供新的分子治療靶點。

1 材料與方法

1.1 模型制備和分組 健康雄性Wistar大鼠45只，體重180～200 g，由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供[合格證號:SCXK(滬)2007-0003]。實驗前適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分成3組：對照組，ALI組和干預組，每組各15只。肌注20%烏拉坦(5 ml/kg)，麻醉起效后，ALI組和干預組經(jīng)陰莖背靜脈緩慢注射LPS(5 mg/kg，Sigma，美國)以建立ALI模型；對照組注射等量的生理鹽水。造模開始的同時，干預組腹腔內注射Eritoran 100 μg(CAS 185955-34-4，上海革遠生物)，其余兩組則腹腔內注射等量的生理鹽水。各組動物再按照觀察時間點平均分為造模后6、12和24 h各3個亞組，每亞組5只。各組大鼠于各時間點麻醉下開胸留取肺組織待檢。

1.2 檢測指標

1.2.1 肺組織病理分析 取右肺下葉用10%中性多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。光鏡下取10個不同視野評估肺組織損傷程度。從肺組織水腫、出血、肺泡壁增厚、肺不張以及炎細胞浸潤等方面綜合判斷，并分別計分。按每類病變累及肺野的范圍計分：0分(無損傷)、1分(損傷范圍<25%)、2分(損傷范圍25%～50%)、3分(損傷范圍50%～75%)、4分(損傷范圍>75%)。各項相加得總分。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液分析 室溫下，用5 ml PBS(0.01 M)自左主支氣管反復灌洗左肺3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，保證3組間BALF容量無差別，平均為(4.2±0.4)ml。全部灌洗液經(jīng)4 ℃，2000 r/min離心10 min，取上清留存待檢。采用ELISA試劑盒(R&D，美國)分別測定BALF上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6濃度變化，每份標本重復測量3次，取平均值。

1.2.3 RT-PCR檢測肺組織TLR-4 mRNA表達 取凍存右肺中葉組織50 mg，加1 ml Trizol，按Trizol試劑說明書操作，加焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。取5 μg RNA，按invitrogen superscriptTMⅢ(invitrogen，美國)試劑說明書操作逆轉錄合成cDNA第1鏈。使用ABI7500全自動熒光定量PCR儀(美國ABI)進行檢測。以GAPDH為內參照，TLR-4引物由Primer Express設計合成。GAPDH上游引物：5'-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3'，下游引物:5'-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA-3'；TLR-4上游引物：5'-GAGGACTGGG TGAGAAACGA-3'，下游引物：5'-GAAACTGCCATGTCTGAGCA-3'。按說明書要求操作，反應結束后，經(jīng)ABI7500 PCR儀自動分析熒光信號并將其轉換為CT值。以內參GAPDH基因為內標，通過隨機附帶相對定量計算分析軟件(RQ Study Software)對各樣本TLR-4基因進行相對定量分析，計算RQ值(2-△△Ct)。

2 結果

2.1 肺組織病理學分析 光鏡下HE染色顯示：對照組大鼠在6、12和24 h時間點，均無明顯的肺損傷病理改變；ALI組在造模6、12、24 h時，右肺下葉組織病理改變主要為肺泡壁水腫、出血、增厚伴肺泡腔炎細胞浸潤，隨著時間延長，病變程度加重；干預組在造模6、12、24 h時，肺組織結構改變均較ALI組減輕，其肺泡結構清晰，僅少量炎細胞浸潤。對照組、ALI組以及干預組造模24 h后肺損傷評分分別為：1.2±0.9、3.3±1.1和1.9±1.0，ALI組評分顯著高于其他兩組(P<0.05)，而干預組與對照組間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 各時點各組支氣管BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量 在6、12和24 h時點，各組支氣管BALF中3種炎癥因子表達水平均是：ALI組>干預組>對照組(P<0.05)。ALI組及干預組隨著時間的延長，炎癥因子濃度逐漸增加，同一組內各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而對照組隨著時間延長，炎癥因子表達無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BALF中炎癥因子濃度比較(n=5,ng/L)

注：與對照組比較，①P<0.05；與同時間ALI組比較，②P<0.05

2.3 肺組織TLR-4基因表達 ALI組肺組織TLR-4 mRNA表達高于干預組和正常對照組，干預組肺組織TLR-4 mRNA表達高于對照組(P<0.05)。在6、12和24 h時點，各組TLR-4 mRNA的表達水平均是：ALI組>干預組>正常對照組(P<0.05)。隨時間的延長，ALI組及干預組TLR-4 mRNA的表達水平逐漸降低，而對照組沒有變化。見表2。

表2 各組不同時間肺組織TLR-4 mRNA的表達(n=5)

3 討論

危重癥患者多合并革蘭陰性菌感染，由此而產(chǎn)生的內毒素血癥，是引發(fā)ALI的主要原因[4]。以過度的全身炎癥反應為特征的SIRS是ALI的發(fā)病基礎，ALI就是SIRS在肺臟的表現(xiàn)，是其嚴重后果。LPS作為內毒素的主要成分，可以誘導肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，靜脈內注射LPS可以導致ALI病理改變，大鼠出現(xiàn)呼吸功能不全和炎癥因子的釋放，呈時間依賴關系，導致肺內眾多炎癥因子釋放。同時肺組織TLR-4基因表達明顯增加。阻斷TLR-4受體后，肺組織內TLR-4基因表達明顯減少，肺臟炎細胞浸潤減少，同時抑制肺組織內炎癥因子釋放，支氣管肺泡灌洗液內炎癥因子濃度也大幅度減低?？梢?，陰莖背靜脈注射一定劑量的LPS，可以成功誘導大鼠外源性ALI，建模成功。

Toll受體家族既為LPS的信號分子，也是LPS的受體[5]。TLR-4作為Toll受體家族成員之一，主要分布于單核-巨噬細胞表面，介導LPS炎癥信號向胞內傳導，是LPS的優(yōu)先受體。目前研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4是脂多糖信號向細胞內傳導的“門戶蛋白”，CD14-TLR-4-MD2膜受體復合物可能是LPS跨膜信號傳導的基本途徑之一。本研究發(fā)現(xiàn)在ALI大鼠模型中，術后6 h肺組織中TLR-4表達就明顯增加，24 h達高峰，并與ALI損傷程度呈正相關關系，這與Zhang等[6]的研究一致。因此，針對TLR-4這一重要環(huán)節(jié)，進行特異性調節(jié)，可能為預防和治療ALI提供新的途徑。目前研究發(fā)現(xiàn)，E5564(Eritoran)是最重要的TLR-4拮抗劑。大量實驗證實，E5564以劑量依賴的方式可以抑制LPS誘導的TNF-α及其他細胞因子產(chǎn)生?；铙w研究發(fā)現(xiàn)，E5564可抑制LPS誘導的細胞因子產(chǎn)生，從而減輕LPS對活體動物導致的致死性損害[3]。本研究干預組加用Eritoran進行處理后，使細胞因子表達減少，肺組織損傷減輕，也充分說明了這一點。因此，TLR-4拮抗劑有可能成為治療LPS誘導急性肺損傷的一種很有希望的藥物。

ALI/ARDS的本質是肺泡內炎癥細胞(巨噬細胞、中性粒細胞等)激活觸發(fā)的急性炎癥反應。炎性細胞釋放大量炎癥介質，其中最具有代表意義的是TNF-α、IL-1β和IL-6[7]。炎癥介質又進一步活化炎癥細胞，通過級聯(lián)瀑布反應，造成肺血管內皮細胞的損傷，肺微血管通透性增高，導致肺組織水腫、出血、纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，ALI模型組隨著時間的延長，支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度逐漸增加，充分證明了這一點。

TNF-α作為一種促炎癥介質，在炎癥刺激早期釋放，參與炎癥反應的多個重要進程。IL-1β主要由白細胞特別是單核-巨噬細胞合成和分泌，是非常重要的促炎癥介質之一，參與機體的炎癥及免疫調節(jié)過程。同時它還誘導血管內皮細胞表面黏附分子，活化巨噬細胞、粒細胞，刺激單核-巨噬細胞合成IL-6、IL-8等因子[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β和IL-6在建模后各個時間點的變化趨勢基本一致。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，靜脈注射LPS引起ALI表現(xiàn)為毛細血管內皮細胞損傷，肺部微血管通透性增大，水腫液及中性粒細胞向肺間質滲出，蛋白含量升高，病理改變以微血管充血、水腫液分布于肺間質內為主。區(qū)別于直接肺部疾患導致的肺損傷，其病理改變以肺泡上皮細胞、肺泡壁斷裂為主，低氧血癥為主要表現(xiàn)。這提醒人們對于臨床上ALI患者要分析病因，區(qū)別對待，才能獲得最好的療效。

總之，TLR-4的表達在LPS誘導的大鼠ALI模型的發(fā)展過程中起重要作用，阻斷TLR-4受體可以抑制肺組織炎癥因子的釋放，減輕肺組織病理損害，達到治療ALI的作用。

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Effects of TLR-4 on inflammatory factor in rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide

Huang Jiyi1,Liu Caiwen1,Lin Jiandong2,Ye Xianlong1,Hong Chaoji3,Zhou Rong4

1.Department of Internal Medicine,Tongmin Hospital,the First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen,Fujian,361000,China;2.Intensive Care Unit,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350000,China;3.Department of Internal Medicine,Xiamen Medical Research Institute,Xiamen,Fujian,361000,China;4.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen,361000,China

Objective To discuss the effects of Toll-like receptor(TLR)4 expression on the inflammatory factors in rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide,and to explore the protection effect of blocking the TLR-4 expression on acute lung injury.Methods Forty five male Wistar rats were randomly divided into normal control group,ALI group,and intervention group with 15 ones in each group.In ALI and intervention groups,the models of acute lung injury were established by the method of intravenous injection with lipopolysaccharide(LPS).The control group

the injection with the same volume of normal saline.All the animals were divided into subgroups of 6,12,and 24 h according to the observation timing of the modeling.Detection was made in the TLR-4 mRNA expression in the lung tissues of those animals and the concentration of the inflammatory factors in the bronchoalveolar lavage fluid.The pathological changes in the rats' lung tissues were observed.Results LPS could lead to the increase of TNF-a,IL-1β,and IL-6 in alveolar space.Blocking the TLR-4 receptor could inhibit the release of inflammatory factors.The evaluation score of lung injury in ALI group was higher than those in the intervention and normal control group(3.3±1.1 vs.1.9±1.0 vs.1.2±0.9).Conclusion Blocking TLR-4 expression can inhibit the secretion of inflammatory factor in ALI rats model induced by LPS,relieve the pathological lesion of lung tissues,and cure ALI.

acute lung injury;Toll-like receptor 4;inflammatory factor

361000 福建 廈門，廈門大學附屬第一醫(yī)院同民分院內科(黃繼義，劉才文，葉先龍)；福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院ICU(林建東)；福建省廈門醫(yī)科所內科(洪朝基)；廈門大學附屬第一醫(yī)院急診科(周 榮)

R 614

A

1004-0188(2014)01-0023-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.009

2013-09-27)