微囊化核桃肽制備及其穩(wěn)定性研究

成 靜，袁宏麗，莫朝暉，陳棟梁

（1.武漢天天好生物制品有限公司，湖北武漢 430090;2.湖北省肽類(lèi)物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430090）

核桃又名胡桃，羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物。醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，核桃對(duì)人體具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、溫腸補(bǔ)腎、止咳潤(rùn)肺、烏發(fā)健腦等作用。核桃蛋白中含有18種氨基酸，其中8種為必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量具有明顯優(yōu)勢(shì)。隨著生物活性肽研究的不斷深入，核桃肽已然成為研究的熱點(diǎn)。已有研究報(bào)道顯示核桃肽具有抗氧化［1－4］、ACE 抑制［5］等生理活性。但由于核桃肽具有良好的親水性，其穩(wěn)定性有限，使其貯存應(yīng)用受到極大的限制。

微膠囊化技術(shù)又稱包埋技術(shù)，是指利用天然或合成的高分子材料（壁材），將固體、液體或氣物料（芯材），經(jīng)包囊所形成的一種具有半透性或密封囊膜微型膠囊的技術(shù)［6］。在食品，日用化工、醫(yī)藥及生物技術(shù)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。用于微囊化的壁材主要分為三種類(lèi)型:天然、半合成及合成。其中β－環(huán)糊精是研究最多的壁材，同時(shí)也是目前工業(yè)上大量生產(chǎn)的環(huán)糊精產(chǎn)品。近年來(lái)研究顯示，以環(huán)糊精為壁材制備的微囊化技術(shù)，可增加物質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性，提高藥物的生物利用率，減少不良反應(yīng)，掩蓋不良?xì)馕兜取５驭拢h(huán)糊精為壁材對(duì)食源性多肽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行微囊化處理的研究鮮少報(bào)道。

本文以β－環(huán)糊精作為包埋壁材進(jìn)行微囊化核桃肽工藝制備，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷榨核桃粕 遼寧長(zhǎng)白仙子生物科技有限公司;堿性蛋白酶 諾維信生物技術(shù)有限公司，酶活2.26×105U/g;木瓜蛋白酶 南寧東恒華道生物科技有限公司，酶活6.0×105U/g;β－環(huán)糊精 禮泉縣化工有限實(shí)業(yè)公司。

DK－98－ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市春斯特儀器有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州杜甫儀器廠;PⅡSS－3CpH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;LPG－5高壓離心噴霧干燥機(jī) 常州市博大制粒干燥設(shè)備有限公司;1100－高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;其它常規(guī)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃肽制備工藝 稱取冷軋核桃粕，按照料液比1∶10，在壓力0.8MPa條件下處理60min，收集沉淀。配制料液比1∶20，恒溫55℃，調(diào)節(jié)pH9，加入4%復(fù)合酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶2）均勻攪拌，酶解5h。100℃滅酶處理，過(guò)濾收集濾液，噴霧干燥制得核桃肽，密封避光保存，備用。

1.2.2 微囊化核桃肽制備工藝單因素實(shí)驗(yàn) 配制一定濃度的β環(huán)糊精溶液，按比例加入核桃肽，在一定溫度條件下，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置室溫，冷藏過(guò)夜，過(guò)濾取沉淀，冰水快速?zèng)_洗，烘干，即得微囊化核桃肽。包埋率計(jì)算公式為:

包埋率（%）=（微囊化核桃肽含量（g）/加入的核桃肽總量（g））×100

1.2.2.1 包埋溫度對(duì)微囊化核桃肽制備工藝的影響

在芯材與壁材比例為1∶10，包埋時(shí)間為60min的制備條件下，考察溫度分別為 20、40、60、80、100℃對(duì)制備工藝的影響。

1.2.2.2 芯材與壁材比例對(duì)微囊化核桃肽制備工藝的影響 在包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為60min的制備條件下，考察芯材與壁材比例分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 對(duì)制備工藝的影響。

1.2.2.3 包埋時(shí)間對(duì)微囊化核桃肽制備工藝的影響在芯材與壁材比例為1∶10，包埋溫度為60℃的制備條件下，考察包埋時(shí)間分別為 30、60、90、120、150min對(duì)制備工藝的影響。

1.2.3 微囊化核桃肽制備工藝正交實(shí)驗(yàn) 以芯材與壁材比例、包埋溫度、包埋時(shí)間為因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，分析確定各因素的最佳組合方式。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》進(jìn)行產(chǎn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。保存條件為（38 ±1）℃，濕度 75%，分別在第 0、30、60、90d 對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、水分含量進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)、多肽、水分含量的檢測(cè)方法參照GB/T 22492－2008《大豆肽粉》。

2 結(jié)果與分析

2.1 微囊化核桃肽制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)

考察不同包埋溫度、不同芯材與壁材比例以及不同包埋時(shí)間對(duì)微囊化核桃肽制備工藝的影響。由圖1可知，在芯材與壁材比例為1∶10，包埋時(shí)間為60min的制備條件下，包埋溫度范圍為20～60℃，微囊化核桃肽包埋率與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)。由圖2可知，在包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為60min的制備條件下，芯材與壁材比例范圍為1∶1～1∶10，微囊化核桃肽包埋率與芯材壁材比例呈現(xiàn)正相關(guān)，芯材與壁材比例范圍為1∶10～1∶20包埋率增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩。由圖3可知，在芯材與壁材比例為1∶10，包埋溫度為60℃的制備條件下，包埋時(shí)間在30～60min，微囊化核桃肽包埋率與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)。包埋時(shí)間在60～150min包埋率增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩。

圖3 包埋時(shí)間對(duì)微囊化核桃肽制備工藝的影響Fig.3 The influence of time on embedding microencalsulated preparation of walnut peptide

2.2 微囊化核桃肽制備工藝正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)芯材與壁材比例、包埋溫度以及包埋時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)微囊化核桃肽制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示影響核桃肽包埋效果的因素主次順序?yàn)?芯材與壁材比例＞包埋溫度＞包埋時(shí)間，此結(jié)論與王向東等對(duì)于β－環(huán)糊精包合多肽類(lèi)物質(zhì)的研究一致［7］。極差分析顯示最佳制備工藝為芯材與壁材比例為1∶10，包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為90min，此時(shí)微囊化核桃肽的包埋率為81.04%。當(dāng)芯材與壁材比例為1∶10，包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為60min，此時(shí)微囊化核桃肽的包埋率為80.05%，與包埋率81.04%差異不明顯，綜合制備工藝中能耗及工時(shí)的考量，微囊化核桃肽的最優(yōu)制備工藝為芯材與壁材比例為1∶10，包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為60min。

表2 微囊化核桃肽制備工藝正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experimental on microencapsulated walnut peptied preparation

2.3 微囊化核桃肽穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照1.2.3實(shí)驗(yàn)方法對(duì)核桃肽以及微囊化核桃肽進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。圖4～圖6結(jié)果顯示，微囊化核桃肽與核桃肽的蛋白質(zhì)及多肽含量在90d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中并無(wú)明顯變化。微囊化核桃肽樣品第0d至第60d水分含量無(wú)明顯變化，第90d水分含量明顯增加。核桃肽樣品第0d至30d水分含量無(wú)明顯變化，第60d至90d水分含量明顯增加，且水分含量增長(zhǎng)趨勢(shì)與時(shí)間呈正相關(guān)。核桃肽水分增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯高于微囊化核桃肽。

圖4 90d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)含量Fig.4 The protein content of 90 days stability test

3 結(jié)論與討論

本文研究結(jié)果顯示以β－環(huán)糊精為壁材微囊化處理核桃肽的最優(yōu)工藝為:芯材與壁材的比例為1∶10，包埋溫度為60℃，包埋時(shí)間為 60min。此條件下制備的微囊化核桃肽包埋率為80.05%。對(duì)微囊化工藝的影響因素主次順序?yàn)?壁材與芯材比例＞包埋溫度＞包埋時(shí)間。90d穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示微囊化核桃肽及核桃肽的蛋白質(zhì)、多肽含量無(wú)明顯變化，核桃肽水分含量增長(zhǎng)趨勢(shì)與時(shí)間呈正相關(guān)，且水分增長(zhǎng)速度明顯快于微囊化核桃肽，提示微囊化核桃肽更加穩(wěn)定，更易于存儲(chǔ)。

圖5 90d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)多肽含量Fig.5 The peptide content of 90 days stability test

圖6 90d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)水分含量Fig.6 The moisture content of 90 days stability test

水分含量在食品保藏中的關(guān)鍵因素之一，可直接影響產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。核桃肽極易吸潮，穩(wěn)定性差，貯存條件要求高。微囊化技術(shù)可改善產(chǎn)品穩(wěn)定性，β－環(huán)糊精結(jié)構(gòu)為上寬下窄的疏水性空腔，能吸收一定大小和性狀的疏水性小分子物質(zhì)或基團(tuán)。本文制備的核桃肽其疏水氨基酸含量高達(dá)18.23%，提示核桃肽含有疏水性區(qū)間。β－環(huán)糊精制成的包合物吸濕性低，有研究顯示在相對(duì)濕度85%的環(huán)境中，其吸濕率不到14%，有利于長(zhǎng)期保存［8］。環(huán)糊精與芯材可以形成二元、三元及多元包合物，其包合模式分為 1∶1 包合（壁材∶芯材）、1∶2 包合、2∶1 包合、2∶2 包合、3∶1 包合、2∶1∶2 包合（壁材∶芯材∶芯材）、2∶2∶1 包合，近幾年文獻(xiàn)報(bào)道顯示能形成穩(wěn)定包合物的一般為1∶1［9］。微囊化核桃肽的結(jié)構(gòu)目前尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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