騰沖菌脂肪酶的表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)的表征

李迅，仲惠，王亮亮，鄧若冰，高紅，王飛

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

脂肪酶（三?；视王ニ饷?，EC 3.1.1.3）廣泛存在于自然界中，能催化水解、醇解、酯化、酯交換、轉(zhuǎn)酯化等多種化學(xué)反應(yīng)的一類酶[1-3]。脂肪酶屬于α/β水解酶超家族，具有典型的α/β水解酶折 疊[4]，催化中心是由絲氨酸、谷氨酸（或者天冬氨酸）和組氨酸組成的催化三聯(lián)體和陰離子氧洞組 成[5]。脂肪酶不僅可在油水兩相界面催化天然底物甘油酯的水解，還可在疏水介質(zhì)中催化酯化、轉(zhuǎn)酯化、酯交換等反應(yīng)。由于脂肪酶具有反應(yīng)活性高、高區(qū)域選擇性和立體專一性等優(yōu)點(diǎn)，成為有機(jī)合成工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的酶，并被廣泛應(yīng)用于生物柴油、油脂加工、醫(yī)藥、食品加工、造紙以及洗滌劑化學(xué)合成等諸多工業(yè)領(lǐng)域[6-8]。

高穩(wěn)定的嗜熱酶的克隆和表征，彌補(bǔ)了常溫酶耐熱性的不足，耐高溫脂肪酶能在高溫下催化反應(yīng)，高溫環(huán)境還能改善某些底物（酯類、脂類）的溶解性和可利用性[9-11]。目前嗜熱脂肪酶的研究取得了一定的進(jìn)展，但還達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求；另一方面，目前來(lái)源于極端嗜熱厭氧菌脂肪酶的報(bào)道不多，缺乏對(duì)嗜熱酶的酶學(xué)性質(zhì)的透徹了解。騰沖菌是一種嗜熱極端耐高溫的細(xì)菌，可以產(chǎn)生耐高溫和具有熱穩(wěn)定性的各種酶類[12]，且騰沖菌基因組測(cè)序已經(jīng)完畢[13]，因此為騰沖菌耐熱性脂肪酶基因的克隆與表達(dá)提供了條件，為開發(fā)可分泌耐熱性且不受其他物質(zhì)抑制的脂肪酶重組菌，對(duì)提高生產(chǎn)效率，開發(fā)功能性產(chǎn)品等具有十分重要的意義。本研究通過(guò)全合成的方法獲取騰沖菌脂肪酶LipA 基因，比較不同啟動(dòng)子對(duì)LipA在大腸桿菌中表達(dá)的影響，并分析了純化的重組LipA 的酶學(xué)性質(zhì)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Top10 購(gòu)自Invitrogen（Carlsbad，California，USA）公司。載體pET-28a、pTrc99A和大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自Novagen（Darmstadt，Germany）公司。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)于Oxoid（Hampshire，England）公司；Ex Taq 聚合酶、Primer Star HS 聚合酶、各種限制性酶購(gòu)于Takara（大連，中國(guó)）公司；常用生物試劑Tris-HCl、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和顯色劑GoldenView 等購(gòu)自南京天為時(shí)代；常用化學(xué)試劑均為分析純。Gel/PCR Extraction Kit、質(zhì)粒小量提取試劑購(gòu)自BIOMIGA（上海，中國(guó)）公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成，全基因合成和測(cè)序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基、SOC 培養(yǎng)基等參考文獻(xiàn)[14]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 騰沖脂肪酶的克隆

根據(jù)騰沖菌脂肪酶基因（Genbank No. NP_62227 ），通過(guò)全基因合成。以構(gòu)建的pMD19T-lipA 質(zhì)粒為模板，根據(jù)騰沖菌脂肪酶基因（Genbank No. NP_62227）序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)ipA-N：GCGCCATGGAAACATCATATTTTGATCCAAC（斜體 為 Nco I 酶 切 位 點(diǎn) ）； LipA-C ：GCGAAGCTTTTCTCATTTTGACAATTGTGCAT（斜體為Hind III 酶切位點(diǎn)）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)Nco I 和Hind III 雙酶切后連入pET28a 和pTrc99A，獲得重組載體pET28a-lipA 和pTrc99A-lipA。

1.2.2 騰沖脂肪酶的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒 pTrc99A-lipA 電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，獲得重組菌株 pTLA-Top10；重組質(zhì)粒pET28a-lipA 電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌株pELA-BL21。

重組菌株搖瓶培養(yǎng)到一定濃度后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶。重組菌pTLA-Top10 和pELA-BL21分別涂布含抗生素 100μg/mL 氨芐青霉素和30μg/ml 卡那霉素的LB 平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落于LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。取樣測(cè)定菌體濃度達(dá)到OD600為0.8 左右時(shí)，加入0.5mmol/L IPTG在37℃誘導(dǎo)8～10h，收集菌體，超聲波破細(xì)胞，于4℃、10000r/min 離心20min，棄沉淀，上清液即為粗酶液。

粗酶液在55℃下熱處理30min，熱處理在水浴鍋中進(jìn)行，熱處理完成后在冰浴中冷卻，于4℃ 20000g 離心2h，保留上清。預(yù)先將DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析柱用 50mmol/L 磷酸緩沖（pH=6.8）平衡好，用熱處理完的酶液上陰離子交換層析柱（1.5×25cm），繼續(xù)用平衡緩沖液洗去未能與填料結(jié)合的蛋白，然后用0～0.4mol/L NaCl濃度梯度洗脫與柱結(jié)合的蛋白，流速為1mL/min。收集活性組分，純化酶液于4℃保存以備后用。采用分離膠濃度為12%SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)及純化效果。

1.2.3 酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15]。取5μL 40mmol/L p-NP-C12，用0.1mol/L 檸檬酸-0.2mol/L Na2HPO4緩沖液（pH4.5）補(bǔ)足至190μL，添加酶液10μL，在適宜溫度立即準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10min 后，加入600μL1mol/L Na2CO3后置于避光的冰上，終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于室溫瞬時(shí)離心后，取上清，記錄410nm 處吸光值。空白樣則用緩沖代替酶液的體積。一個(gè)酶活單位（U）定義為在pH 值7.5、80℃條件下，每分鐘釋放1μmol 對(duì)硝基苯酚所需的酶量。蛋白濃度的測(cè)定方法采用Bradford 法[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組載體的構(gòu)建

以構(gòu)建的pMD19T-lipA 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增得到LipA 成熟肽編碼序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)Nco I 和Hind III 雙酶切后連入pET28a，獲得重組載體pET28a-lipA，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（Nco I 和Hind III）鑒定正確[圖1(a)]后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，條帶大小分別為5240 bp（pET28a）和1157 bp（lipA）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)Nco I 和Hind III 雙酶切后連入pTrc99A，獲得重組載體pTrc99A-lipA。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（Nco I 和Hind III）鑒定正確[圖1(b)]，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)與嗜熱騰沖菌脂肪酶基因序列（GenBank No. NP_62227）同源性達(dá)99.9%，氨基酸序列一致，說(shuō)明lipA 已經(jīng)被成功克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10 中表達(dá)，條帶大小分別為4150 bp（pTrc99A）和1157 bp（lipA）。

2.2 啟動(dòng)子對(duì)重組LipA 表達(dá)的影響

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

圖2 不同啟動(dòng)子對(duì)重組CALB 表達(dá)的影響

對(duì)比不同質(zhì)粒pET28a（啟動(dòng)子為T7）和pTrc99A（啟動(dòng)子為Trc）對(duì)LipA 基因在大腸桿菌中表達(dá)的影響，10% SDS-PAGE 電泳圖顯示（圖2），a-1 和b-1 樣品為轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的大腸桿菌全細(xì)胞液，均無(wú)明顯的目的條帶。a-2 和b-2 樣品為轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的全細(xì)胞液，表達(dá)量差異大，a-2 圖在42kDa 處 有明顯的蛋白條帶，與已知的LipA 大小42 kDa 相近，而b-2 樣品表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于a-2 樣品，幾乎觀察不到重組條帶。以Trc 啟動(dòng)子型的重組菌較T7啟動(dòng)子型的重組菌具有更高的表達(dá)量和酶活。trc 啟動(dòng)子是trp 啟動(dòng)子和lac 啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，它具有比trp 更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lac I 阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。因此，選擇Trc 啟動(dòng)子型的重組菌（pTrc99A-lipA+Top10 重組菌）進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.3 重組酶的純化

質(zhì)粒pTrc99A-lipA 電轉(zhuǎn)大腸桿菌Top10，經(jīng)誘導(dǎo)獲得 LipA 粗酶液。通過(guò)熱處理和DEAE-Sepharose 陰離子柱純化過(guò)程，重組LipA 得到純化，其中熱處理后的重組酯酶無(wú)法被疏水柱吸附， 主要酶活都在流出液中， 因此改用DEAE-Sepharose 陰離子柱純化，結(jié)果如圖3。

由圖3 可知，lane 4 樣品是經(jīng)熱處理后的，比lane3 即破壁后的上清純度高，表明熱處理使很多不耐熱蛋白變性沉淀，而LipA 是嗜熱酶，熱處理可把大部分雜蛋白去除，保留了大部分LipA 活性，回收率達(dá)到71%，純化倍數(shù)為5 倍。Lane 5 是經(jīng)陰離子柱層析后的，目的條帶為電泳純的重組酯酶，回收率為20%，純化倍數(shù)為12 倍，純酶的比酶活為99U/mg。重組LipA 在10% SDS-PAGE 凝膠電泳顯示相對(duì)分子量為42kDa。

圖3 重組脂肪酶的純化過(guò)程

2.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.4.1 LipA 的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

分別在50～99℃下測(cè)定重組LipA 酶活，結(jié)果如圖4(a)所示，重組LipA 在80℃時(shí)酶活達(dá)到最大，隨著溫度的升高，酶活呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在65～95℃之間仍保持較高活力。將適當(dāng)濃度酶液分別置于75℃、80℃、85℃、90℃、95℃和100℃下分別保溫0、30min、60min、90min、120min，將保溫后酶樣于pH 值4.5 和80℃條件下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖4(b)所示，在85℃下重組LipA 保持較高的溫度穩(wěn)定性，保溫120min 后，該酶的活力依舊能保持60%以上。在95℃保溫60min 后殘余約45%的酶活。由此可認(rèn)為，在95℃以下的溫度，該酶能保持著較好的穩(wěn)定性。

2.4.2 最適pH 值和pH 值穩(wěn)定性

圖4 重組LipA 的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在80℃下，將等量酶液分別于pH 值3.0～9.0的不同緩沖液中測(cè)定LipA 酶活，結(jié)果如圖5(a)所 示，在0.1mol/L 檸檬酸-0.2mol/L Na2HPO4緩沖液中，重組LipA 在pH 值為4.5 時(shí)酶活力最高，且在pH 值4.0～6.0 之間都具有較高活力。在50mmol/L PB 緩沖液（pH 值6.0～8.0）和50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 值 7.0～9.0）中，酶活都隨著pH 值的增大而下降。微生物的脂肪酶大多是堿性脂肪酶，而LipA 卻是酸性，這可能與嗜熱騰沖菌本身的性質(zhì)有關(guān)，如來(lái)自嗜熱騰沖菌的α-葡萄糖苷酶TtGluA和TGluB 最適反應(yīng)pH 值都為5.0[17]。

取適當(dāng)量酶液分別置于上述不同pH 值的緩沖液中保溫1 h，將保溫后的酶液都在pH 值 4.5℃、80℃條件下測(cè)定酶活。結(jié)果如圖5(b)所示，在pH值 4.0～6.0 的環(huán)境中重組LipA 較為穩(wěn)定，能保持60%以上的酶活力，而在過(guò)酸過(guò)堿條件下，酶活喪失則較為明顯。

此結(jié)果與Zhang 等的結(jié)果[16]有較大差異，他們的結(jié)果顯示LipA 的最適溫度為70℃，且到90℃酶活完全喪失，80℃時(shí)保溫20min，酶活力只能保持20%左右；最適pH 值為9.0，而低于pH 值6.0，便無(wú)酶活顯示。重組酶的最適溫度有較大差異的原因，可能是Zhang 等未在最適pH 值條件下測(cè)定溫度對(duì)酶的影響。最適pH 值的差異最大，本實(shí)驗(yàn)的最適pH 值為4.5，而Zhang 等結(jié)果顯示最適pH 值為8.0，分析原因，在酶活測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚（pNP-OH）會(huì)顯示黃色，這也是反應(yīng)結(jié)束時(shí)需要使用Na2CO3來(lái)終止反應(yīng)的原因，若沒(méi)有使用Na2CO3終止反應(yīng)，酸性條件下由酶解產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚會(huì)顯色不完全，測(cè)得的酶活偏小。

圖5 重組LipA 的最適pH 值和pH 值穩(wěn)定性

2.4.3 金屬離子和化學(xué)試劑的影響

將5mmol/L 的Cu2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、0.05% SDS 和0.25% Tween 20分別加入酶液中，加入底物p-NP-C12后，于pH 值4.5、80℃測(cè)定酶活，結(jié)果如表1 所示。Al3+對(duì)該酶有較大的抑制作用，Cu2+和Zn2+對(duì)酶活力分別有38.9%和69.2%的抑制作用，Mn2+、Co2+和Tween-20對(duì)該酶有50%以上的激活作用，其他金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組LipA 無(wú)明顯促進(jìn)或抑制作用。和Zhang 等結(jié)果相比，除了Mn2+和Tween-20 對(duì)LipA的影響差別較大之外，其他結(jié)果基本一致。

2.4.4 重組LipA 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在含有適當(dāng)酶量的反應(yīng)體系中分別加入終濃度37.5～112.5μmol/L 的p-NP-C12，于pH 值4.5、80℃條件下反應(yīng) 10min，測(cè)定重組 LipA 酶活，以Lineweaver-Burk 法作圖，求得該酶的米氏常數(shù)Km為1.5mmol/L，催化常數(shù)kcat為34.5s-1。由此可見(jiàn)重組LipA 與p-NP-C12的親和力相對(duì)較低，下一步工作可對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化研究以改進(jìn)其性能。

3 結(jié) 論

（1）pTrc99A-lipA 中含有的Trc 啟動(dòng)子比pET28a-cyp 含有T7 啟動(dòng)子更有利于LipA 的表達(dá)。通過(guò)熱處理和DEAE-Sepharose 陰離子柱純化過(guò)程，可得到電泳純的重組LipA 酶。純化后的LipA 酶活達(dá)到99U/mg，純化過(guò)程中回收率為20%，回收倍數(shù)為12。重組LipA 分子量為42kDa。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響

（2）純化的重組LipA 最適反應(yīng)溫度為80℃，最適pH 值為4.5，且在95℃以下和pH 值4.0～6.0條件下具有較好的穩(wěn)定性。Cu2+和Zn2+對(duì)酶活力有一定的抑制作用，Mn2+、Co2+和Tween-20 對(duì)該酶有較大的激活作用。該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和 kcat分別為1.5mmol/L 和34.5s-1。

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