羅漢松種子提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞的體外抑制作用

周 燕，隗 磊，譚志明，余尚工，方念伯，劉合剛

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065;2. 全南厚樸生態(tài)林業(yè)有限公司，江西 贛州 341000)

羅漢松科植物羅漢松 Podocarpus macrophyllus (Thunb. )D.Don 是松樹(shù)的一種，又名羅漢杉、長(zhǎng)青羅漢杉、土杉、金錢松、仙柏、羅漢柏、江南柏，為常綠喬木。研究表明，羅漢松屬植物所含的雙黃酮、芹菜素等成分對(duì)胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌癥均有一定的防治作用[1-2]。目前尚未見(jiàn)羅漢松種子提取物體外抗腫瘤方面的研究，故本試驗(yàn)中以人胃癌細(xì)胞MGC-803 為研究對(duì)象，探討羅漢松種子提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

BC-R1001A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);FD-12HL 型超低溫冷凍干燥機(jī)(北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司);BHC-1300 ⅡA/B 型生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司);NU-5510E46603 型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE);XD-101 型倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Sunrise，瑞士TECAN 公司);一次性培養(yǎng)瓶、96 孔板(Corning 公司);AB-135 -S 型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);TDZ5 -WS 型低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司);WD-9405B 型水平搖床(沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司);SP-756P 型紫外分光光度計(jì)(上海市光譜儀器有限公司);PCR 儀(Bio-RAD，伯樂(lè)公司);FluorChem Q 型多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Protein Simple 公司)。乙醇為分析純(國(guó)藥試劑有限公司);DMEM 培養(yǎng)基(Corning 公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);雙抗(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);0.25%胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);PBS(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO，科瑞生物);噻唑藍(lán)(MTT，科瑞生物科技有限公司);總RNA 提取試劑盒(日本Bioflux 公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI Fermantas 公司);熒光染料(伯樂(lè)公司);DEPC 水、瓊脂糖、Tris-base、硼酸、DNA 上樣緩沖液、EDTANa2及Gelred(美國(guó)Amresco 公司);羅漢松種子(全南厚樸生態(tài)林業(yè)有限公司)。人胃癌MGC-803 細(xì)胞(安徽中醫(yī)學(xué)院李慶林教授提供)。

1.2 方法

羅漢松種子提取物制備:取3.14 kg 羅漢松種子，粉碎后加入3 倍量95%的乙醇熱回流提取，提取3 次，每次2 h，趁熱過(guò)濾，合并所得濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得凍干粉，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞培養(yǎng):MGC-803 細(xì)胞置于37 ℃、飽和濕度、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液DMEM 含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2 ～3 d 傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)分組:分為羅漢松種子提取物處理組(試驗(yàn)組)和空白對(duì)照組。試驗(yàn)組精密稱取羅漢松種子提取物凍干粉2.0 mg，加10 μL DMSO 及990 μL DMEM 使其溶解，過(guò)濾，得到羅漢松種子提取物貯備液，精密吸取貯備液50，100，200 μL，分別置離心管中，再分別加入DMEM 定容，使其終質(zhì)量濃度為25，50，100 μg/mL;空白對(duì)照組只加DMEM 培養(yǎng)液。

MTT 試驗(yàn):取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后吸出原培養(yǎng)液，加入含有不同質(zhì)量濃度(0，25，50，100 μg/mL)羅漢松種子提取物的培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h 后，每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，置水平搖床低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇酶標(biāo)分析儀490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定每孔吸光度值(OD 值)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

RT -PCR 檢測(cè)羅漢松種子提取物對(duì)MGC -803 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響:用胰酶消化收集0，25，50，100 μg/mL 4 個(gè)不同質(zhì)量濃度羅漢松種子提取物作用48 h 后的MGC -803 細(xì)胞，采用Simply P 總RNA 提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA 的純度，進(jìn)行RT -PCR，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2 和p53 的表達(dá)。bcl-2 基因的引物序列，F(xiàn) 為5' -AGAGTGCTGAAGATTGATTGATGGGAT-3'，R 為5' -CTTTGCATTCTTGGACGAGG -3'，擴(kuò)增片段274 bp。P53 基因的引物序列為F:5'-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3'，R 為5'-TTCCGTCCCAGTAGATTACCA -3'，擴(kuò)增片段236 bp。β -actin 基因的引物序列，F(xiàn) 為5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，R 為5'-CACCTTCACCGTTCCAGTTT -3'，擴(kuò)增片段190 bp。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94 ℃5 min;40 個(gè)循環(huán)，變性94 ℃30 s，退火59 ℃45 s，延伸72 ℃45 s;加長(zhǎng)延伸72 ℃5 min。擴(kuò)增結(jié)束后將目的基因置1.2%的瓊脂糖凝膠水平電泳槽內(nèi)電泳，電泳完畢后在多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT 值來(lái)表示基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率以百分率表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn);細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量采用單因素方差分析(one-way-AVOVA)，組間比較用LSD 法。試驗(yàn)結(jié)果以± s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)MGC-803 細(xì)胞的增殖抑制作用

與對(duì)照組比，質(zhì)量濃度分別為25，50，100 μg/mL 的羅漢松種子提取物作用MGC-803 細(xì)胞24，48，72 h，細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P ＜0.01)。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，藥物對(duì)MGC-803 的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，并呈一定的時(shí)效關(guān)系;隨著作用濃度的增大，藥物對(duì)MGC-803 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也明顯增強(qiáng)，并呈濃度依賴性。見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度羅漢松種子提取物對(duì)MGC-803 細(xì)胞增殖抑制的影響(n=5)

2.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2 及p53 的表達(dá)

提取的各組細(xì)胞的mRNA OD260/ OD280比值均在1.8 ～2.0之間，說(shuō)明RNA 純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。目的基因擴(kuò)增曲線平滑，溶解曲線為特異單峰。給藥48 h 后，bcl -2 基因表達(dá)顯著下調(diào)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，給藥25 μg/mL，bcl -2 mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P ＜0.05);給藥50，100 μg/mL，bcl-2 mRNA 表達(dá)水平極降低更顯著(P ＜0.01)。p53 基因則隨給藥質(zhì)量濃度的增加而表達(dá)增多，與空白對(duì)照組比較，給藥100 μg /mL 能顯著上調(diào)p53 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(P ＜0.05)。見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 bcl-2、p53 mRNA RT-PCR 結(jié)果

3 討論

胃癌為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織公告，居世界癌癥死亡率第2 位。我國(guó)的胃癌高發(fā)，患病率和死亡率均是世界平均水平的2 倍多。目前，臨床上治療胃癌主要采用外科切除、藥物化學(xué)治療、放射治療，但其對(duì)機(jī)體均會(huì)帶來(lái)一定損傷和毒副作用。中藥在改善患者體質(zhì)、降低化學(xué)治療藥物毒性等方面有突出作用。本試驗(yàn)通過(guò)觀察不同質(zhì)量濃度羅漢松種子提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)、增殖、凋亡的影響，探討了其對(duì)人胃癌細(xì)胞抑制作用及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，藥物在體外能明顯抑制胃癌細(xì)胞MGC-803 的增殖，且其抑制作用呈質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴性。bcl-2 基因位于18q21，可對(duì)多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起抑制作用，其表達(dá)在胃腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。bcl-2 蛋白在胃癌組織呈高表達(dá)，并在高、中分化胃癌中表達(dá)率高于低分化胃癌，提示bcl-2 通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，羅漢松種子提取物作用于MGC-803 細(xì)胞48 h，凋亡抑制基因bcl-2 表達(dá)呈顯著性下降。因此，羅漢松種子提取物可能是通過(guò)抑制凋亡抑制基因bcl-2 的表達(dá)，繼而抑制bcl-2 蛋白的表達(dá)，從而抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開(kāi)放，繼而抑制凋亡通道下游Caspase 的活性，來(lái)發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。p53 基因最早發(fā)現(xiàn)于1979 年，最初被認(rèn)為是一種有顯性轉(zhuǎn)化作用的內(nèi)核癌基因。直到1988 年，才提出p53 基因是一種腫瘤抑制基因。該基因位于17p13，它可與多種癌基因和生長(zhǎng)因子協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。在細(xì)胞發(fā)生DNA 損傷時(shí)，p53 蛋白能使細(xì)胞分裂終止在G1/S期，使細(xì)胞有足夠時(shí)間修復(fù)損傷，恢復(fù)正常狀態(tài)。若不能修復(fù)，野生型p53 基因能啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程，從而引發(fā)細(xì)胞的程序性死亡，阻止具有癌變傾向的突變細(xì)胞產(chǎn)生[3]。野生型p53 基因的功能喪失或突變會(huì)導(dǎo)致異常的細(xì)胞周期惡性循環(huán)，使細(xì)胞失控，從而形成惡性腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用48 h 后，與空白對(duì)照組比較，給藥100 μg/mL 時(shí)p53 基因表達(dá)水平顯著增加(P ＜0.05)。綜上所述，羅漢松種子提取物對(duì)MGC-803 細(xì)胞具有增殖抑制作用，可能與調(diào)控相關(guān)凋亡基因有關(guān)。

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